摘要:利用响应面法探究高压电场工作频率、电压、时间及氧气比例对槟榔的杀菌效能特性,结果表明:一定范围内,杀菌率 随 工 作 频 率、电 压、时 间 的 提 高 而 显 著 升 高 (P<0.0 5),当频率>1 00 Hz、时间>15 0 s,杀菌率变化不显著(P>0.0 5);回归分析表明频率的升高与电压、时间临界值的变化呈正相关(R 2 =1),说明频率、电压及时间对槟榔杀菌有明显的交互作用;最佳杀菌参数为处理频率 11 0 Hz、处理电压 70.5 kV、氧气比例 40%、处理时间 1 80 s,此时 的 杀 菌 率 为 9 7.20%,与 预 测 值 (9 7.3 2%)接近,而且槟榔碱含量无明显变化,表明高压电场低温等离子体对槟榔包装产品有显著的杀菌效果,并对产品品质无显著影响。
关键词:低温等离子体;槟榔包装产品;工作电压频率;菌落总数;杀菌率;槟榔碱
槟榔(Areca catechu )因具有独特的风味口感,在 湖南乃至全中国发展规模迅速。由于槟榔产品的生产加工环境开放度高、包装及从业人员手工操作,易导致槟榔成品微生 物 超 标,这 是 影 响 槟 榔 产 品 合 格 率 的 主 要 原因[1 -2]。目前,槟榔的杀菌研究主要集中在初生产环节,如热杀菌、SO2 熏蒸、添加防腐保鲜剂等[3-4],而关于槟榔成品的有效杀菌方法研究较少,主要有辐照杀菌、微波杀菌、脉冲强光杀菌[5-7],但这些方法或对槟榔品质造成负面影响,或存在设备价格高、操作要求严格等问题。高压电场低温等离子体冷杀菌(cold plasma cold sterilization, CPCS)是一种新兴的食品冷杀菌技术,该技术可与气调包装完美结合,具有温升小、能耗低、无污染、无残留、作用时间短、操作简便等优点[8],特别适用于热敏性食品的杀菌。
CPCS 是在电极之间放置密封包装的样品,通过对电极施加高压,激发电极板内空气产生活性氧(ROS)、活性氮(RNS)和紫外线光子等活性成分[9-1 0],这些活性成分具有良好的杀菌作用,可与样品表面微生物接触,对细胞 DNA、脂质、蛋白质、细胞膜等造成损伤,从而使微生物失活死亡[11 -1 3]。同时,这些活性成分的存留时间较短,半衰期较长的臭氧及其他活性成分在 24 h 内会逐渐转变为基态[1 4]。研究[15-1 6]表明,低温等离子体技术对食品具有很好的杀菌效果。Misra 等[1 7]研究发现低温等离子体处理电压 6 0 kV,处理草莓 5 min 就能有效减少草莓的菌落总数。乔维维等[1 8]发现介质阻挡放电低温等离子体在电压强 度 7 2 kV 的 条 件 下 处 理 牛 肉 8 6 s,杀 菌 率 高 达 9 3.7 5%。目前,关于 CPCS 技术用于槟榔杀菌的研究尚未见报道,试验拟以湖南散装槟榔为原材料,探究 CPCS 对槟榔的杀菌效果影响,在不影响其品质的基础上,优化杀菌工艺参数,为低温等离子体技术在槟榔的冷杀菌领域提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
散装槟榔:菌落总数为 4.6 lg(CFU/g)左右,湖南皇爷食品有限公司;
平板计数培养基 (PCA)、氯化钠:青岛海博生物技术有限公司;
槟榔碱标准品:上海源叶生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
高压电场低温等离子体:CPCS-1 型,南京苏曼等离子体科技有限公司;
复合气调包装机:MAP-H3 6 0 型,配有气体比例检测装置,苏州森瑞保鲜设备有限公司;
电热恒温培养箱:DHP-9 0 1 2 型,上海一恒科学仪器有限公司;
液相色谱仪:Agilent 1 2 6 0 型,美国安捷伦公司。
1.3 方法
1.3.1 槟榔的处理 与槟榔接触的镊子、包装盒提前用 7 5%的酒精消毒,并于超净台中灭菌 3 0 min。称取槟榔 2 5 g 于聚丙烯包装盒(1 7 cm×1 2 cm×3.2 cm)中,随机选取 3 盒,对照组为空气包装,处理组按不同因素水平气调包装后进行 CPCS 处理,每个处理重复 3 次。
1.3.2 单因素试验
(1)CPCS 处理频率对槟榔杀菌率的影响:固定处理电压 70.5 kV,处理时间 15 0 s,间隔时间 3 0 s,气体组成 40% O2 、3 0% CO2 、3 0% N2 ,处理频率分别为 6 0,70,80, 9 0,1 00,11 0,1 20 Hz。
(2)CPCS 处理电压对槟榔杀菌率的影响:固定处理频率 1 00 Hz,处理时间 15 0 s,间隔时间 3 0 s,气体组成 40% O2 、3 0% CO2 、3 0% N2 ,处理电压分别为 42.5,4 9.5, 5 6.5,6 3.5,70.5 kV。
(3)CPCS 氧气比例对槟榔杀菌率的影响:固定处理电压 70.5 kV,处理频率 1 00 Hz,处理时间 15 0 s,间隔时间 3 0 s,固定 N2 比例 3 0%,O2 +CO2 比例分别为 1 0%+ 6 0%,20% + 5 0%,3 0% + 70%,40% + 3 0%,5 0% + 20%,6 0%+1 0%。
(4)CPCS 处理时间对槟榔杀菌率的影响:固定处理电压 70.5 kV,处理频率 1 00 Hz,气体组成为 40% O2 、 3 0% CO2 、3 0% N2 ,间隔时间 3 0 s,处理时间分别为 3 0, 6 0,9 0,1 20,15 0,1 80,2 1 0 s。
1.3.3 响应面法优化 在单因素试验基础上,以处理电压、处理频率、氧气比例、处理时间为自变量,杀菌率为响应值,对槟榔杀菌率进行响应曲面优化。
1.3.4 指标测定
(1)菌落总数:样品经 CPCS 处理后,置于自封袋中, 加入 2 2 5 mL 无菌生理盐水,均质器以 1 2 次/s 正反面各拍打 1 min,选取合适梯度的稀释液 1 mL 于平板,倾注灭菌冷却的 PCA 摇晃混合均匀,每个梯度重复 3 次,凝固后于 3 7 ℃培养箱培养 1 8~24 h。以未经 CPCS 处理的槟榔为 对 照 组,按 GB 47 8 9.2—20 1 6 方 法 进 行 菌 落 总 数计数。
1.3.5 数据分析 试验结果均用 Excel 软件整理作图,方差分析和显著性检验采用 SAS 9.4 软件中 GLM 程序分析(P<0.0 5),响应曲面试验采用 Design-Expert 8.0.5 软件分析作图,所有试验重复 3 次,结果以(平均值±标准偏差)表示。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 CPCS 处理频率对槟榔杀菌率的影响 由图 1 可知,槟榔杀 菌 率 随 CPCS 处 理 频 率 的 增 加 先 显 著 (P < 0.0 5)升高,当处理频率>1 00 Hz 后趋于平缓。随着处理频率的增大,等离子设备的放电功率增大,增加了高能粒子的密度,低温等离子体释放的活性物质等杀菌成分与食品微生物接触,从而杀死微生物。Takaki 等[2 0]发现介质阻挡放电低温等离子体设备在放电过程中,随着放电频率的增大,样品空间内产生更多的活性粒子,而这些活性粒子正是杀菌的关键物质,与试验结果一致。此外,处理频率的变化决定整个体系温度的变化,虽然高频率具有更好的杀菌效果,但会使反应体系的温度升高,不适用于热敏感食品的杀菌,也不利于食品品质的保障。因此选择处理频率为 9 0~11 0 Hz。
2.1.2 CPCS 处理电压对槟榔杀菌率的影响 由图 2 可知,槟榔杀菌率随电压强度的增大显著(P<0.0 5)提高。一般而言,随 电 压 的 升 高,激 发 产 生 的 等 离 子 体 浓 度 越高,产生的活性成分更多,有利于臭氧和 H2 O2 等杀菌成分的生成,杀菌效果越明显[2 1]。Kim 等[2 2]研究发现,等离子体的电压强度对猪腰肉病原菌的杀菌有显著影响, 其杀菌率随电压的增高而增大。马良军等[2 3]研究发现电压为 70,80 kV 时,原始菌从 8 lg(CFU/mL)分别降至 6, 3 lg(CFU/mL),杀菌效果随电压强度的增大而提高。试验中在 70.5 kV 的试验电压下,菌落总数从 4.65 lg(CFU/g) 降至3.00 lg(CFU/g),可能是因为样品的状态(固态或液态)会影响杀菌效果,液态、光滑表面的样品经 CPCS 处理后会产生明显的杀菌效果,而对于一些表面粗糙的样品如槟榔,达到相同杀菌效果则需更高的条件[2 4]。此外,样品的初始菌数越多,同等条件下 CPCS 杀菌效果越显著。因此选取电压为 5 6.5~70.5 kV。
2.1.3 CPCS 氧气比例对槟榔产品杀菌率的影响 目前气调包装 技 术 常 用 的 气 体 是 O2 、N2 、CO2 。气 体 组 成 会影响等离子体形成成分的组成,从而影响杀菌效果。Kim 等[2 5]发现在纯氩气中加入一定量的氧气会使活性氧的杀菌效果更高。CO2 能抑制大多数腐败细菌和霉菌生长繁殖,N2 是惰性气体,一般不与食品发生化学反应,用以维持包装外形。由图 3 可知,当氧气比例为 1 0%~40%时, 杀菌率显著(P<0.0 5)升高;当氧气比例>40%时,杀菌率呈下降趋势。研究[2 6]表明 O2 有利于低温等离子体产生活性氧等活性物质,其中含氧活性成分在杀菌过程中起主要作用。马良军等[2 7]研究发现,低温等离子处理单增李斯特菌时,随着包装内 O2 浓度的提高,单增李斯特菌完全致死所需时间明显降低。当包装内 O2 含量较低时,激发产生的含氧活性成分量少,对微生物的致死作用不明显;逐渐提高 O2 浓度,叠加 CO2 的抑菌作用导致杀菌率逐渐上升;当 O2 含量过于饱和时,激发产生的活性氧等杀菌自由基量有限,即使再增大 O2 比例,微生物的致死率也不会有显著变化,同时 CO2 的抑菌作用进一步减弱,二者叠加会导致杀菌率呈缓慢降低趋势。因此,综合考虑选择 O2 比例为 20%~6 0%。
2.1.4 CPCS 处 理 时 间 对 槟 榔 产 品 杀 菌 率 的 影 响 由图 4可知,低温等离子体杀菌效果随处理时间的延长先显著(P <0.0 5)上升,当处理时间超过 15 0 s 后趋于平缓。 Niemira 等[2 8]利用等离子体处理苹果时,发现所有处理组 的杀菌率随处理时间的增加而增加。Misra等[1 7]研究等离子体对樱桃的杀菌过程,发现随着处理时间的延长, 杀菌率越高。Hu 等[2 9]研究低温等离子体对大肠杆菌的杀菌过程发现,杀菌率随处理时间的延长先上升后趋于平缓,与试验结果一致。这是由于随着处理时间的延长, 产生的等离子体中的活性成分浓度增大,对槟榔表面微生物的钝化效果越好;然而,当活性成分在包装内累积至一定程度时,其对样品表面微生物致死作用有限。因此选取处理时间为 1 20~1 80 s。
2.2 响应面试验
2.2.1 响应面因素水平设计 根据单因素试验结果,以处理电压、处理频率、处理时间和氧气比例为影响因素, 以杀菌率为指标,设计四因素三水平响应面优化试验,各因素水平表见表 1,试验结果见表 2。
2.2.2 回归模型建立及显著性分析 利用 Design-Expert 软件对试验数据进行二次多项式回归拟合分析,得杀菌率对自变量回归方程为:
Y = - 1 1 6 0.82 + 11.2 1A + 1 6.74B + 1.40 7C + 0.3 7 8D +0.0 7 3AB -6.7 5 ×1 0 -3 AC +0.0 1 3AD -4.6 4× 1 0 -3 BC - 3.8 × 1 0 -3 BD + 1.8 3 × 1 0 -3 CD - 0.084A 2 - 0.1 7 2B 2 -7.6 8×1 0 -3C 2 -4.4 1×1 0 -3 D 2 。 (2)
由表 3 可知,回归模型极显著(P<0.000 1),失拟项不显著(P=0.15 6 9 >0.0 5),说 明 该 模 型 与 试 验 拟 合 较好;R 2 =0.9 7 2 3,R 2 Adj =0.9 44 7>0.8,可有效地体现低温等离子体杀菌效果与各处理因素的关系。A、B 和 D 对杀菌率 影 响 极 显 著 ,C 、AB 、AD 、A 2 和 B 2 对 杀 菌 率 影 响显著;各因素对槟榔杀菌率影响大小依次为处理电压> 处理频率>处理时间>氧气比例。
本文来源于：《食品与机械》(双月刊)创刊于1985年，由长沙理工大学湘潭市食品机械总厂主办。是中国食品科学技术学会会刊，中文核心期刊，中国科技核心期刊，旨在指导行业发展,促进科技进步,指引投资方向,引导产品开发，设有权威论坛、科研开发、市场分析、提取与活性、安全与检测、生产应用、机械与设计、包装与设计、个案分析、专论与综述等栏目。
2.2.3 处理频率和处理电压的交互作用 由图 5 可知,处理频率和处理电压的曲面倾斜程度较大,等高线呈椭圆形,表明处理频率和处理电压对杀菌率影响显著,且两因素间交互作用显著(P<0.05),同时,处理电压比处理频率的曲面斜率更大,说明处理电压对杀菌率的影响更显著。
由表 4 可知,一定电压强度下,处理频率越偏离临界值,杀菌率越低。将处理频率临界值对电压进行线性回归分析可知,处理频率对低温等离子体杀菌率影响的临界值随处理电压的升高呈线性上升 趋 势(y = 0.434x + 7 6.445,R 2 = 1 ),且 变 化 显 著 。当 电 压 从4 9.5 kV上 升 至70.5 kV 时,杀菌率从 3 0%迅速上升至 9 5%附近,表明杀菌率随处理电压的升高呈明显的上升趋势,当处理电压为 70.5 kV 时,杀菌率达最高值,与单因素试验结果基本一致。
由表 5 可知,处理电压对等离子体杀菌率影响的临界值随处理频率的升高呈线性增大趋势(y =0.2 1 2 8x + 4 6.45 9,R 2 = 1 ),杀菌率随处理频率的升高先上 升 后 降低,当处理频率继续上升至 1 20 Hz 时,杀菌率略有降低。低温等离子体产生于密闭包装空间内,所产生的活性氧等自由基的含量在高能粒子间的复杂反应条件下,成分发生转变,因此在较高的处理频率下杀菌率反而降低,表明在实际杀菌过程中,处理频率不宜过高。
2.2.4 处 理 频 率 和 处 理 时 间 的 交 互 作 用 由 图 6 可知,处理频率和处理时间的曲面倾斜程度较大,等 高 线呈椭圆形,表明处理 频 率 和 处 理 电 压 对 杀 菌 率 影 响 显著,且交互作用明显(P<0 .0 5 )。处理频率比处 理 时 间的响应曲面斜率更 大,说 明 处 理 频 率 对 杀 菌 率 的 影 响更显著。
由表 6 可知,处理频率对杀菌率影响的临界值随处理时间的延长呈线性上升趋势(y =0.0 7 7 5x + 9 5.4 6 6, R 2 =1)。当 处 理 时 间 为 1 5 0 s 时 ,杀 菌 率 上 升 趋 于 平 缓 ,与单因素试验结果基本保持一致。
由表 7 可知,处理时间对低温等离子体杀菌率影响的临 界 值 随 处 理 频 率 的 上 升 呈 线 性 升 高 趋 势 (y = 1.47 3 9x +20.742,R 2 = 1 )。当 处 理 频 率 为 0 ~ 11 0 Hz 时,杀菌率显著上升;当处理频率为 11 0 Hz 时,杀菌率有所降低。因此,实际杀菌应用过程中,为达到杀菌快速高效的目的,尽量选择处理时间短且处理频率不宜过高的条件。综上,当处理频率为 1 0 7.0 5~11 0.00 Hz,处理时间为 15 0.00~1 82.8 7 s 时,槟榔杀菌率达最高值。
2.2.5 CPCS 工艺优化 经 Design-Expert 软 件 分 析 可知,最 佳 工 艺 条 件 为 处 理 频 率 1 08.7 8 Hz、处 理 电 压 6 9.1 7 kV、氧气比例 44.3 7%、处理时间 1 80 s,此条件下杀菌率达 9 7.3 2%。考虑到实际设备操作的方便性,调整为处理频率 11 0 Hz、处理电压 70.5 kV、氧气比例 40%、处理时间 1 80 s,修正后的杀菌率为 9 7.20%(n =3),相对误差为 0.1 2%,表明该模型的预测值与实际试验值吻合度高,响应面法优化结果可靠。
2.3 CPCS 对槟榔品质指标的影响
由表 8 可知,CPCS 处理后对槟榔的水分含量、粗纤维、槟榔碱无显著影响(P>0.0 5),表明高压电场低温等离子体杀菌处理后,对槟榔的主要品质指标无明显影响 (P>0.0 5)。
3 结论
高压电场低温等离子体的处理电压、处理频率、处理时间和氧气比例对槟榔杀菌影响显著(P<0.0 5)。处理频率的升高与处理电压、处理时间临界值的变化呈正相关 (R 2 =1),处理频率与处理电压、处理频率与处理时间的交互作用对槟榔杀菌率的影响显著(P<0.0 5);高压电场低温等离子体处理槟榔的最佳条件为处理频率 11 0 Hz、处理电压 70.5 kV、氧气比例 40%、处理时间 1 80 s,该条件下的杀菌率为 9 7.20%,经杀菌后槟榔碱等主要品质指标含量无明显变化。低温等离子体的杀菌效果还受空气湿度、气体流速、包装材料等因素的影响,且对不同品种的槟榔杀菌效果也不尽相同。不同空气湿度及包装材料对槟榔杀菌效果和品质的影响还有待探索。——论文作者：曹丽娜1 CAO Li-na 1 章建浩1 ZHANG J ian-hao 1 王晓婷2 WANG Xiao-ting 2 魏巧云3 WEI Qiao-yun 3 王艺月3 WANG Yi-yue 3 严文静3 YAN Wen-j ing 3
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