摘 要:为建立耐除草剂转基因作物的高通量检测方法，本试验以目前生产上广泛应用的 5 种除草剂抗性基因 dmo、pat、CP4EPSPS、bar 和 aad1 为靶标进行多重 PCR( MPCR) 研究。通过引物适用性测试、反应体系中的不同引物浓度和反应程序中的退火温度测试、灵敏度和特异性验证等，建立了能同时检测 5 种除草剂抗性基因的 MPCR 检测方法。结果表明，当 dmo、pat、CP4EPSPS、bar、aad1 基因的检测引物终浓度分别为 0. 2、0. 2、0. 3、0. 4、0. 2 μmol·L-1 ，退火温度为 63℃时 5 种靶标扩增效果较好，且特异性条带清晰且均一。此外，MPCR 检测方法具有较好的特异性，对每种靶标的检测灵敏度均可达到 0. 1%。适用性测试结果显示，MPCR 检测方法可对含有 5 种除草剂抗性基因的多种转基因作物的单个品系或多个品系混合物进行筛选检测。无假阳性和假阴性结果表明，MPCR 检测方法对实际样品具有很好的适用性。本试验结果为筛选高效耐除草剂转基因作物检测技术提供了一定的理论依据。
关键词:转基因作物; 除草剂抗性基因; 多重 PCR; 筛选检测
自 1983 年第一例转基因作物问世以来，全球转基因作物发展迅猛，根据国际农业生物技术应用服务组织 ( International Service for the Acquisition of Agribiotech Applications，ISAAA) 统计数据显示，2016 年全球 26 个国家共种植 1. 851 亿 hm2 的转基因作物，较 2015 年增长约 3%，较 1996 年增加 110 倍[1]。除草剂对农田杂草具有良好的防治效果，在农事管理操作中发挥重要作用，随着各类除草剂抗性基因的挖掘及遗传改良技术的发展，耐除草剂转基因作物研发取得了显著进展，已成为全球范围内推广应用面积最大的转基因作物类型[1]。2016 年全球种植的耐除草剂转基因作物( 包括抗虫和耐除草剂复合性状) 约 1. 62 亿 hm2 ，占转基因作物种植总面积的 87. 5%，较 2015 年增长约 5%[2]。目前，除草剂抗性基因在转基因大豆、玉米、油菜、棉花、甜菜等作物中均有报道[3]。
转基因技术作为一项新型高新技术，其产品的食用安全性和环境安全性受到了广泛关注[4]，因此，很多国家和地区对转基因技术及其产品建立了相应的管理法规，如安全评价制度、标识监管制度等[5]。为确保这些监管制度的实施，国内外学者围绕转基因产品精准、快速检测技术等开展了大量研究，其中 PCR 是最常应用的转基因分子检测技术，已建立了一系列以外源调控元件、标记和报告基因、目的基因、转化体成分等为靶标的单一 PCR 检测方法[6-7]。
多重pcr检测耐除草剂转基因作物相关期刊推荐：《核农学报》(ISSN1000-8551)创刊于1987年，由中国农业科学院农产品加工(原子能利用)研究所主办，是核技术和生物物理技术在农业和生物学应用研究领域唯一的学术期刊，主要刊登核技术(包括各种辐射源人工诱变遗传和育种技术、食品加工技术和同位素示踪技术等)在农业科学中应用的学术论文、综述、科技信息及知识介绍等。此外，还刊登其他相关技术，如农产品和食品贮藏加工、分子生物学、环境保护、生态农业、农业生物技术、节水农业等方面的学术论文。有投稿需求的作者，可以直接与在线编辑联系。
在转基因产品分子检测时，一般先对几种常见转基因成分，如外源调控元件、目的基因等进行筛查，确认样品中是否存在转基因成分，然后再进行转基因身份鉴定[8-9]。随着转基因成分筛选元件种类的增多，采用单一 PCR 方法存在操作繁琐、耗时低效、成本较高等不足，而多重 PCR( multiplex PCR，MPCR) 技术可在同一个检测体系中加入多种检测引物，实现对多种靶标 DNA 的同时检测，显著提高了检测效率[10]。由于 MPCR 体系较以单个基因为检测对象的普通 PCR更复杂，且技术难度大，因此在建立 MPCR 方法时需对不同靶标的引物用量及反应条件进行优化测试，确保建立的 MPCR 方法有足够的特异性和灵敏度[11-12]。近年来，大量的研究学者运用 MPCR 技术对转基因产品进行分子检测，如张耀川等[13]利用 MPCR 技术建立了 7 种转基因油菜籽转化体的检测方法; 董立明等[14]采用 MPCR 技术建立了转基因大豆品系的高通量检测方法; 李飞武等[15]建立了能同时检测 8 种 Bt 基因的多重简并 PCR 方法; Xu 等[16]利用 MPCR 技术结合 PAGE 电泳建立了 9 种外源基因和 6 种内源基因的 15 重 PCR 方法; 傅凯等[17]建立了 13 个转基因玉米品系的 MPCR-芯片检测方法; Heide 等[18]将 MPCR 与毛细管电泳结合建立了 8 种转基因玉米品系的高通量检测方法。但已报道的方法多见于对筛选元件、抗虫基因及转基因玉米、油菜等品系特异性的研究，对转基因耐除草剂作物的 MPCR 检测方法尚鲜见报道。
针对耐除草剂转基因作物，以除草剂抗性基因为靶标对象的特异性检测方法是转基因产品日常监管和筛选检测的重要技术手段之一，而建立快速高效的检测方法已成为转基因分子检测技术研究的重点[5]。 CP4EPSPS、bar、pat、aad1、dmo 5 个基因是当前应用最广泛的除草剂抗性基因。本 研 究 以 含 有 dmo、pat、 CP4EPSPS、bar 和 aad1 5 个耐除草剂基因的转基因作物为试验材料，通过引物设计与筛选、MPCR 反应体系、反应条件优化、特异性检测、灵敏度测试、适用性验证等，以期建立能同时检测转基因作物中 5 种除草剂抗性基因的 MPCR 方法。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 试 验 材 料 转 基 因 玉 米 ( Bt11、T25、 MON88017、NK603、Bt176、DAS40278-9) ，转基因大豆 ( MON87708、MON89788、GTS40 - 3 - 2、A2704 - 12、 A5547 - 127 ) ，转 基 因 棉 花 ( MON1445、MON88913、 LLCOTTON25) ，转基因油菜( GT73、Topas19 /2、RF1) ，转基因甜菜( H7-1) 及非转基因作物样品均由吉林省农业科学院转基因检测实验室收集并保存。每种转化体及适用性测试样品中含有的除草剂抗性基因信息详见表 1。
1. 1. 2 主要试剂 植物基因组提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司; HS-Taq DNA 聚合酶、dNTPs 等购自大连宝生物有限公司; GeneFinder 核酸染料、琼脂糖等购自北京鼎国生物有限公司。所有引物均由上海生工生物有限公司合成和纯化。
1. 2 方法
1. 2. 1 样品基因组 DNA 的提取 取 100 ～ 200 mg 样品粉 末，利 用 DNA 提取试剂盒提取样品的基因组 DNA，用 ND1000 微 量 紫 外/可见分光光度计 ( 美 国 NanoDrop 公司) 测定 DNA 样品的纯度和浓度，并根据浓度测定值稀释至 25 mg·L-1 ，4℃保存备用。
1. 2. 2 阳性对照 DNA 样品的制备 将转基因玉米 NK603、Bt176、Bt11、DAS40278 - 9 及 转 基 因 大 豆 MON87708 的基因组 DNA 等体积混合制成阳性对照 DNA 样品，其中每个转化体 DNA 成分的质量浓度为 5 mg·L-1 ( 相当于质量分数为 20%) 。
1. 2. 3 引物的设计及筛选 以常见除草剂抗性基因 dmo、pat、CP4EPSPS、bar、aad1 的核苷酸序列为模板[19-20]，按照 MPCR 引物设计原则，应用引物设计软件 Primer Premier 5. 0 设计上述 5 个靶标基因的引物，其序 列、预期扩增产物大小等信息详见表 2。用 ddH2O 将引物干粉溶解并稀释至 10 μmol·L-1 。
1. 2. 4 单重 PCR 扩增体系 扩增体系为 25 μL，包含 10×PCR 缓冲液 2. 5 μL，dNTPs 混合液 2 μL( 每种 dNTP 终浓度为 0. 2 mmol·L-1 ) ，上、下游引物各 1 μL，热启动 Taq DNA 聚合酶 0. 25 μL( 5 U·μL-1 ) ，DNA 样品 2 μL，加 ddH2O 补充至 25 μL。每个样品设 3 次重复。
1. 2. 5 MPCR 扩增体系 扩增体系为 25 μL，包含 10 ×PCR 缓冲液 2. 5 μL，dNTPs 混合液 2 μL，dmo、pat、 aad1 基因的上下游引物各 0. 5 μL，CP4EPS 基因的上下游引物各 0. 75 μL，bar 基因的上下游引物各 1. 0 μL，热启动 Taq DNA 聚合酶 0. 25 μL ( 5 U·μL-1 ) ， DNA 样品 2 μL，加 ddH2O 补充至 25 μL。每个样品设 3 次重复。
1. 2. 6 扩增程序及产物检测 单一和五重 PCR 采用相同的扩增程序: 94℃ 预变性 5 min; 94℃ 变性 30 s， 63℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 60 s，35 个循环; 72℃ 延伸 7 min。取 7. 5 μL PCR 扩增产物，用 2%琼脂糖凝胶电泳进行检测分析。
2 结果与分析
2. 1 引物筛选
本研究中，CP4EPSPS 基因的检测引物直接采用国家标准中的简并引物，而 dmo、pat、bar 和 aad1 基因则在系统分析各个检测靶标的序列信息及现有方法基础上，重新设计了适用于建立 MPCR 的引物，并对新引物的特异性进行测试。扩增结果显示，新设计的 4 对引物可从 aad1、bar、pat 和 dmo 4 种靶基因的阳性对照样品中分别扩增出 130、220、461 和 627 bp 的预期产物( 图 1) 。为保证所设计引物序列的特异性，将设计的引物序列提交 NCBI 数据库( http: / /blast.ncbi. nlm.nih.gov /Blast.cgi) 进行核苷酸序列检索比对，结果显示所有引物序列与主要农作物基因组 DNA 均不具有同源性，从理论上验证了引物在转基因作物检测中的特异性。
2. 2 MPCR 引物适用性
为验证 aad1、bar、CP4-epsps、pat 和 dmo 5 种靶基因的检测引物在 MPCR 体系中的适用性，以阳性对照 DNA 样品及相应的单一转化体 DNA 为模板，进行五重 PCR 扩增。测试结果显示，应用此 MPCR 体系在阳性对照样品中可获得 5 个靶基因的预期扩增产物，而在单一转化体样品中仅获得与预期片段大小一致的单一目标产物，表明用这 5 对引物建立 MPCR 检测体系是可行的( 图 2) 。
2. 3 MPCR 反应体系及反应程序的优化结果
为确定 MPCR 检测体系的最适引物配比和反应程序，设置 3 个引物配比方案( 反应体系中 dmo、pat、 CP4EPSPS、bar、aad1 的引物终浓度分别为 0. 2、0. 2、 0. 2、0. 4、0. 2 μmol·L-1 ，0. 2、0. 2、0. 3、0. 4、0. 2 μmol·L-1 ，0. 2、0. 2、0. 4、0. 4、0. 2 μmol·L-1 ) ，4 种退火温度( 60、61、62、63℃ ) ，以阳性对照 DNA 样品及其 5 倍稀释液为测试样( 标记为 1 ×和 0. 2 ×阳性 DNA 样品) ，进行引物浓度和退火温度的二因素 MPCR 正交试验。结果表明，当 dmo、pat、CP4EPSPS、bar、aad1 基因的检测引物浓度分别为 0. 2、0. 2、0. 3、0. 4、0. 2 μmol·L-1 ，退火温度为 63℃ 时，利用五重 PCR 方法在 2 个测试样品中均能得到 5 种靶标基因的特异性扩增产物，且条带清晰均一。
2. 4 MPCR 方法的灵敏度分析
将阳性对照 DNA 样品用 0. 1×TE 进行梯度稀释，制备了 8 份灵敏度测试样，测试样品中含每种靶标基因的样品 DNA 质量浓度分别相当于 1. 25、0. 5、0. 25、 0. 125、0. 05、0. 025、0. 012 5、0. 002 5 mg·L-1 ，利用优化好的反应体系和反应程序进行五重 PCR 扩增。由图 3 可知，当 DNA 样品浓度≥0. 025 mg·L-1 时，可获得全部 5 种靶标基因成分的特异性扩增产物，而当 DNA 样品浓度≤0. 012 5 mg·L-1 时仅能获得部分预期扩增产物，表明该五重 PCR 方法对每种靶标基因的检出限为 0. 025 mg·L-1 。按每个体系中加入 2 μL 模板计算，本研究建立的五重 PCR 方法对每种靶标基因的检出限均可达 50 pg; 按初始 DNA 浓度 25 mg·L-1 测算，相对检出限为 0. 1%，可满足转基因作物中相应除草剂抗性基因成分的精确检测需求。
2. 5 MPCR 检测方法对不同组分样品的适用性
将耐除草剂转基因作物进行混合，制成含 2 ～ 5 种靶标基因的适用性测试样品( 表 1) ，每个样品中每种靶标基因的 DNA 质量浓度为 0. 25 mg·L-1 ( 相当于质量分数为 1%) ，进行 MPCR 检测体系的适用性测试。由图 4 可知，应用五重 PCR 方法能够从 11 个适用性测试样品中分别扩增到 2～ 5 个特异性产物，在空白对照和阴性对照样品中均无扩增，且未出现假阳性或假阴性情况，与表 1 所列的预期结果一致，表明本研究建立的五重 PCR 方法适用于各种复杂样品中 5 种除草剂抗性基因的精准检测。
3 讨论
MPCR 技术作为一种经济高效、准确可靠的高通量检测手段，广泛运用于转基因成分检测，检测对象既有常见的调控元件、标记基因和目的基因[15，22-23]，也有转基因玉米[24]、大豆[25-26]、油菜[13]、棉花[27-28]、番木瓜[29]等转化体成分，前者可实现筛查目的，后者可对转基因成分进行身份鉴定。由于 cp4-epsps、bar 和 pat 基因在转基因作物中已被广泛长期应用，前人对 CP4EPSPS、bar 和 pat 基因的 PCR 或 ELISA 检测方法[30-31]进行了研究并形成了相应的国家标准[32，21]，如龙丽坤等[33]建立了 aad1 和 dmo 双重 PCR 检测方法。但尚未有基于高通量技术同时筛查上述 5 种除草剂抗性基因的报道。本研究针对国内外广泛应用的 5 种除草剂抗性基因建立了五重 PCR 检测方法，为基于外源目的基因的转基因成分筛选检测提供了一种新的技术手段。
一种可靠的高通量检测方法不仅需要有严格的特异性和灵敏度，还需具有在复杂样品中正确检出预期靶标成分的适应性。本研究通过一系列试验建立的五重 PCR 检测方法可对含 CP4EPSPS、bar 等 5 种靶标基因成分的单个转化体或多个转化体的混合物进行准确鉴定，对每个靶标的检测灵敏度可达 0. 1%，与前人报道的多重 PCR 方法的技术指标一致[10，30]，表明本研究新建的五重 PCR 方法可作为耐除草剂转基因作物及其产品的筛查手段。
据统计，目前我国已批准进口的 49 个转基因作物转化体中有 34 个含有除草剂耐受性，其中 30 个含有本研究中使用的除草剂抗性基因。根据已有的试验结果及检测引物与靶标核苷酸序列的比对，本研究建立的五重 PCR 方法可以对这 30 个含有 CP4EPSPS、bar、 pat、aad1 或 dmo 基因的耐除草剂作物进行筛选检测，分别占已批准进口的全部转化体和耐除草剂转化体的 61. 2%和 88. 2%。本研究结果表明，MPCR 检测方法具有较好的检测覆盖度，是一种高效的检测手段，可为我国转基因作物监管和检测提供一定的技术支撑。 4 结论本研究建立了以 CP4EPSPS、bar、pat、aad1、dmo 5 个常见除草剂抗性基因为靶标的 MPCR 检测方法，该方法具有良好的特异性，对每种靶标的检测灵敏度可达到 0. 1%，适用于各种复杂样品中相应转基因成分的快速高效筛查。与现行标准中的常规 PCR 方法相比，本研究建立的 MPCR 方法有效提高了检测效率，降低了检测成本，进一步完善了转基因产品成分检测技术手段，在玉米、大豆、棉花、油菜、甜菜等农作物及其产品的转基因成分筛选检测工作中具有较好的应用前景。
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