摘要：从传统发酵蓝莓饮料中分离、筛选出发酵性能优异的乳酸菌，为蓝莓相关产业的深加工提供理论依据。采用IonS5XL测序平台对样品中细菌16SrDNAV4区进行高通量测序，发现乳杆菌属(Lactobacillus)为主要发酵菌属，相对丰度为69.1%。通过分离鉴定共得到50株乳酸菌，与16SrDNA数据比对，其中8株菌株与相对丰度排名前十的聚类单元代表序列相似度为100%。进一步根据产酸、耐受性能测试及在发酵蓝莓果汁中生长状态最终筛选得到2株植物乳杆菌，菌株编号为TUST-L4和TUST-L27，适用于乳酸菌发酵蓝莓饮料的开发。
关键词：乳酸菌;蓝莓;分离;鉴定;菌种筛选
乳酸菌是一种具有安全性且常用发酵食品的微生物[1]。乳酸菌能够在适宜条件下快速繁殖、产酸，使发酵基质的pH值迅速降低，不仅有效抑制耐酸能力较差的微生物在发酵基质中的生长繁殖，还能够赋予发酵食品独特的味道[2]。目前，乳酸菌被广泛应用于酸奶[3]、泡菜[4]、酸菜[5]和发酵型饮料[6]等发酵食品中。
传统发酵蓝莓饮料主要采用自然发酵的方式，利用水果果皮、环境或地域等天然存在的微生物作为发酵菌株[7]，通过微生物间的优胜劣汰来完成发酵。其中，主导发酵的菌株多为乳酸菌[8]，但仍存在一些杂菌和少数致病菌，并且该方法存在发酵工艺不易控制和成品品质参差不齐等缺点。近年来，研究人员采用直投菌种的方式实现发酵蓝莓果汁[9]，但多采用商业化的菌株，缺少对其针对性的筛选。利用生物学手段从自然发酵的蓝莓饮料中分离筛选出发酵性能优异的菌株，对于产品生产、质量控制和安全性具有实际意义[10]，并可为后续研究发酵机理和功能成分代谢提供了理论基础。
本文从传统发酵蓝莓饮料中分离和鉴定出乳酸菌，分析其产酸能力、耐受性能力和蓝莓发酵过程中的生长能力，从而筛选出可用于发酵蓝莓果汁的乳酸菌。
1材料与方法
1.1材料与试剂传统发酵蓝莓饮料：黑龙江省伊春市。
MRS培养基、MRS肉汤：北京陆桥技术股份有限公司;细菌DNA提取试剂盒：TIANGEN生化科技(北京)有限公司。
1.2仪器与设备
全自动生长曲线分析仪(FP-110-C)：芬兰Bio-screenC公司;数码生物显微镜(DN-117M)：宁波永新光学股份有限公司;pH计(FE-28)：瑞士梅特勒公司;高压灭菌器(HVA-85)：日本HIRAYAMA公司;凝胶成像仪和电泳仪：美国Bio-Rad公司;离心机(5804R)：德国Eppendorf公司。
1.3方法
1.3.1样品DNA提取及16SrDNA测序
传统发酵蓝莓饮料样品送至天津诺禾致源生物信息科技有限公司，采用十六烷基三甲基溴化铵法(cetyltrimethylammoniumammoniumbromide，CTAB)法[11]提取样品DNA，以515F-806R为引物扩增细菌16SV4区，并进行高通量测序文库的构建和IonS5XL平台的单端测序。
1.3.2乳酸菌的分离纯化及保种
将传统蓝莓发酵饮料样品等梯度稀释后涂布于含有2%碳酸钙的MRS培养基[12]，37℃厌氧培养(48±2)h。挑取平板上具有溶钙圈的菌落进行三区划线，重复3次，得到纯化菌株。将纯化后的菌株接入MRS肉汤中，37℃过夜静置培养。吸取10μL该菌液再接入MRS肉汤中重复培养3次后，进行保种及菌种鉴定。
1.3.3乳酸菌的鉴定与形态学分析
参照TIANGEN基因组DNA提取试剂盒[13]说明书进行DNA提取。以DNA为模板进行聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)扩增，引物分别为27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)[14]。经琼脂糖凝胶电泳检测，将条带清晰且单一[15]的PCR产物送至金维智生物科技有限公司进行测序。序列比对采用GenBank中的BLAST进行分析(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)[16]。
对鉴定后的菌株进行菌落特征观察和细胞形态学观察[17]。
1.3.4乳酸菌初筛
利用Geneious软件将乳酸菌纯化菌株的16SrDNA序列与样品高通量测序中所有聚类单元(operationaltaxonomicunit，OTU)代表序列进行比对，选出与乳酸菌的OTU代表序列匹配度为100%的菌株。
1.3.5乳酸菌复筛
1.3.5.1产酸试验
将初筛得到的菌种以5%的接种量接入MRS肉汤中，厌氧培养24h后测定菌液pH值，确定各菌株产酸能力。
1.3.5.2胃液及胆汁耐受能力
参考Charteris和Pacheco等[18-19]方法测定胃液及胆汁耐受能力，略有改动，具体方法如下：
取1mL菌液，4℃、12000r/min离心5min，弃去上清液，用生理盐水洗涤2次，将沉淀于1mL生理盐水中充分混匀。在10mL人工胃液(pH2.0)和10mL人工胆汁中分别加入100μL上述菌液，分别在37℃下孵育1h和2h。参考GB/T4789.35-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》进行活细胞计数[20]。
1.3.6乳酸菌生长曲线的绘制
参考刘书亮等[21]方法测定生长曲线，略有改动，具体方法如下：
以5%的接种量将上述菌种分别接入MRS肉汤中，转至100孔板中，利用全自动生长曲线分析仪测定其生长曲线。37℃培养，每隔1h测定吸光度(检测波长600nm)。以培养时间为横坐标，菌液OD600值为纵坐标，绘制生长曲线。
1.3.7乳酸菌发酵蓝莓果汁终点活细胞计数
将乳酸菌培养至对数期，以5%的接种量接入蓝莓果汁中，于37℃静置发酵。取发酵72h的发酵液进行乳酸菌活细胞计数[22]。
1.3.8数据分析
利用Excel2016、SPSSStatistics20.0等统计软件进行数据处理和分析。
2结果与分析
2.1传统发酵蓝莓饮料的物种相对丰度
分析传统发酵蓝莓饮料中的微生物组成可以更好地控制生产工艺以及成品质量，通过16SrDNA高通量测序得到的传统发酵蓝莓饮料中细菌属水平物种相对丰度如图1所示(仅展示相对丰度排名前十的物种)。
传统发酵蓝莓饮料属水平物种相对丰度中只有乳杆菌属(Lactobacillus)和假单胞菌属(Pseudomonas)超过1%，说明其优势物种相对明显。Lactobacillus在各样品中的相对丰度介于65.4%~73.2%之间，均值为69.1%，相对丰度排名第一，菌群优势明显。研究表明，Lactobacillus是很多发酵食品中的主要发酵菌[3-6]。研究人员从发酵食品中分离得到该产品的主要优势菌并加以利用[23]，不但较大程度上还原了发酵食品的风味而且在产品质量上也得到较好的控制。Pseudomonas在各样品中的相对丰度介于1.5%~12.1%之间，均值为8.5%，相对丰度排名第二，不是主要的发酵菌，可能在发酵过程中与发酵菌协同完成发酵，有报道称其与Lactobacillus为芥菜发酵过程中的主要微生物[24]，或者是由于成品低温储存时间过长导致其生长[25]。
2.2菌落和菌体形态学分析
通过分离纯化得到部分纯化菌株菌落和菌体形态，如图2所示。
图a和b中菌落为圆形，边缘整齐，菌落中心隆起，菌落为白色，不透明，菌落周围有明显透明圈，说明菌落周围的碳酸钙被分解;图c中菌落呈白色，不透明，边缘整齐，较为扁平;图d、e和f中菌体均为短杆状，菌体颜色为紫色，说明其均为革兰氏阳性杆菌。
2.3乳酸菌鉴定结果
以提取的纯化菌株基因组DNA为模板，扩增产物琼脂糖凝胶电泳图如图3所示。
16SrDNA扩增产物在1000bp~1500bp之间，产物的电泳条带单一且清晰，满足测序要求。
经过MRS碳酸钙平板划线分离，共得到50株疑似乳酸菌菌株。将50株菌株的测序结果与GenBank中已知序列进行同源性比对，确定测序菌株的种属信息，结果汇总于表1。
50株疑似乳酸菌菌株均为乳杆菌属(Lactobacil-lus)，其中25株为布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri);11株植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum);10株干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei);3株短乳杆菌(Lactobacil-lusbreris);1株戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)。本次分离鉴定得到的菌种在传统发酵食品中均有过相关报道，如姜雪晶等利用布氏乳杆菌通过混合发酵，可有效改善了酸菜成品品质[26]。植物乳杆菌与人类的生活息息相关，常用于奶油、肉类及许多蔬菜发酵制品中，其能够通过消化道进入肠道并定植从而发挥有益作用[27]。干酪乳杆菌能够抑制和杀死食品中的许多腐败菌和致病菌，并具有降胆固醇、抗肿瘤和提高人体抵抗力等益生功能[28]。由此可见，分离得到的菌种通过进一步的筛选试验可作为发酵剂应用于发酵食品。
2.4乳酸菌初筛
将上述50株乳酸菌16SrDNA序列与高通量测序得到的OTU代表序列进行BLAST比对。筛选与相对丰度排名前十的聚类单元代表序列匹配度为100%的菌株进行后续试验，筛选结果见表2。
共筛选出8株乳酸菌，其菌株编号分别为：TUSTL4、TUST-L26、TUST-L27、TUST-L36、
2.5乳酸菌生长曲线
为了直观反应乳酸菌纯化菌株在培养基中的生长情况，对8株乳酸菌进行了生长曲线测定。图4展示了8株乳酸菌在MRS肉汤中培养18h内OD600变化情况。
从图4中可以看出，8株乳酸菌均都在1h左右进入对数期，在8h~10h时进入稳定期，稳定期的OD600值均在1.4~1.6之间。
2.6乳酸菌复筛
2.6.1乳酸菌产酸能力
乳酸菌发酵产生的有机酸能够改善产品口感和风味，并能有效抑制耐酸性较差的微生物生长[29]，预防发酵过程中杂菌污染。因此，对8株乳酸菌产酸能力进行测定，结果汇总于表3。
风味，并能有效抑制耐酸性较差的微生物生长[29]，预防发酵过程中杂菌污染。因此，对8株乳酸菌产酸能力进行测定，结果汇总于表3。
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