摘要: 原代人脐静脉内皮细胞培养技术存在诸多不足，永生化能延长细胞生命周期并保持稳定的内皮细胞源性，使不同细胞及细胞代之间保持同质性，为血管内皮细胞及其相关疾病的研究提供良好的细胞模型。目前以猿猴病毒 40 大 T 抗原基因和人端粒酶逆转录酶催化亚基基因诱导人脐静脉内皮细胞永生化最常用; 介导外源基因进入内皮细胞的载体常见的有病毒类和非病毒类两种，以逆转录病毒载体或慢病毒载体最常用。可回复性永生化技术有望为内皮细胞永生化提供更好的选择性。
关键词: 人脐静脉内皮细胞; 永生化; 猿猴病毒 40 大 T; 人端粒酶逆转录酶催化亚单基
肿瘤生长依赖于肿瘤新生血管的生成，因此抗肿瘤血管生成可作为抗肿瘤治疗的一种有效途径。抗肿瘤血管生成的靶向药物已被研发并应用于临床肿瘤治疗，成为治疗肿瘤的有效策略[1-2]。体外培养的内皮细胞可为研究内皮细胞的病理生理、肿瘤血管生成机制以及抗肿瘤血管生成提供良好的细胞模型。目前原代血管内皮细胞体外模型多采用原代人脐静脉内皮细胞( human umbilical vein endothelial cells，HUVECs) 。但原代 HUVECs 培养技术存在的不足限制其进一步的研究和应用。因此，研究者通过各种方式使 HUVECs 发生永生化改变，增强 HUVECs 的增殖能力，延长原代 HUVECs 的生命周期并保持稳定的内皮细胞源性，使不同细胞及细胞代之间保持同质性，为血管内皮细胞及其相关疾病的治疗提供良好的细胞模型基础。现就 HUVECs 永生化的研究进展进行综述。
1 原代 HUVECs 培养技术
通过脐静脉获取并体外培养的原代 HUVECs 是血管内皮细胞重要的细胞模型。早在 20 世纪 60 年代，Maruyama[3]最先获取 HUVECs 并进行相关研究和探索，但未就 HUVECs 的纯度、形态以及细胞鉴定等问题给出统一、明确的结论。直到 20 世纪 80 年代 Jaffe 等[4]和 Gimbrone 等[5]才对原代HUVECs 的获取方法和鉴定方法等给出结论。此后，研究者在前人的基础上不断研究探索，慢慢总结出获得质量较好的原代 HUVECs 的培养方法。原代培养常用的方法有酶消化法和非酶消化法，前者通过消化酶消化相关组织获取细胞，目前常用这种方法，通常所用的消化酶包括胶原酶和胰蛋白酶; 非酶消化法通过刮取、螯合法以及组织块培养法等从脐静脉中直接分离获取 HUVECs，其缺点是分离过程中易混杂脐静脉血管壁其他类型的细胞，难以保证获取细胞的纯度，目前应用较少。
目前 HUVECs 的分离技术已经相当完善，技术要点如下[6-7]: ①脐带的获取与保存: 无菌条件下获取脐带，保存于 4 ℃的缓冲液中，6 h 内消化分离获取细胞; ②磷酸盐缓冲液冲洗静脉管腔，清除残留血污并修剪脐静脉破损或夹痕损伤处; ③消化酶消化: 置于 37 ℃孵箱中消化约 15 min; ④消化完全后在含 15% 胎牛血清的完全培养基中中和消化酶，离心获取细胞沉淀; ⑤细胞重悬后将细胞悬液培养于含 15% ～ 20% 胎牛血清的完全培养基中，于 37 ℃、 5% 二氧化碳的条件下在培养箱中培养。HUVECs 的鉴定标准如下[3，8-9]。①生长特性: 在光学显微镜下 HUVECs 呈短梭形或鱼贯样，或呈多角形铺路石样排列生长，在基底胶中有管状成形能力。②细胞代谢: 具有血管紧张素转换酶活性，能产生前列环素，具有一氧化氮合酶活性。③可用于鉴别 HUVEC 的特异性标志物如 v-W 因子( Ⅷ因子) 、W-P 小体等。
脐带的取材来源丰富，易获取。脐静脉便于操作且能保证 HUVECs 的足量收集。原代 HUVECs 保留了原来内皮细胞的遗传特性，能很好地反映和模拟体内内皮细胞的生物学特性[9]，因此是研究血管系统结构和相关疾病的良好细胞模型。获取的原代内皮细胞也具有一定的局限性[10]: 原代 HUVECs 的获取费时费力，短时间内难以大量获取; 消化过程中难免有其他血管壁细胞的掺杂污染，难以保证所获细胞的纯度; 因细胞获取来源不同而难以保证不同批次细胞间的同质性; 原代 HUVECs 体外培养时间有限，一般经过 3 ～ 4 代传代培养后细胞便开始停止增殖，逐渐衰老和死亡[11]; 在培养过程中，原代 HUVECs 的细胞性状易发生改变，难以保证细胞功能、结构及代谢的稳定。为构建更好的体外内皮细胞模型，人们开始探索研究既能使细胞保持稳定的增殖能力又能保持内皮细胞源性、不发生恶性转化的方法。
2 永生化的定义及途经
正常细胞体外培养生存周期有限，增殖能力受限，经过有限次数传代后细胞就会出现生长抑制状态，并逐渐衰老和死亡。永生化是指体外培养的细胞自发或受外界因素影响逃离衰老机制的调控，从而获得体外无限增殖能力的过程[12]。永生化细胞在体外培养时能无限传代，有稳定的增殖特性，并保持着细胞原有的分化特性，为血管内皮细胞的相关研究提供了理想的体外细胞模型。
细胞永生化有多种方法。在自然环境中，细胞在某些情况下能发生自发性永生化，但发生率极低[13-14]。研究人员采用了理化、生物等多种方法诱导体外培养的细胞发生永生化，如通过放射性因素[15]或药物等诱导细胞发生永生化，但通过这些理化途径诱导的永生化易使细胞发生恶性转变。人们通常所用的方法是将外源性永生化基因如病毒[猿猴病毒 40( simian virus 40，SV40) 、EB 病毒、人乳头瘤病毒等]、原癌基因( c-myc、vsrc、c-Jun 等) 或抑癌基因( p53、pRb、乳腺癌 1 号基因、胰腺癌缺失基因 4) 及人端粒酶逆转录酶催化亚单基( human telomerase reverse transcriptase，hTERT) 等通过相关载体转染至目的细胞，使外源性永生化基因在靶细胞基因组中整合并表达，进而建立永生化细胞株。在 HUVECs 的永生化中最常用猿猴病毒 40 大 T( simian virus 40 large T，SV40LT) 抗原基因和 hTERT 基因诱导。慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体等与细胞永生化相关的各类载体也在不断构建并应用于细胞永生化的研究中。
3 HUVECs 永生化相关载体
目前常见的介导外源基因转入细胞并使其发生永生化的相关载体有病毒类和非病毒类两种。非病毒类载体主要是质粒载体，通过电击法、磷酸钙沉淀法、脂质体转染法或显微注射法等将携带永生化目的基因的质粒直接导入目的细胞，虽然其价格低廉，但是存在靶向困难、转染效率低下、稳定性差等缺点，并且随着细胞的增殖分裂会出现质粒丢失的现象。
病毒类载体包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体以及腺相关病毒载体等。腺病毒载体以及腺相关病毒载体介导的目的基因表达稳定性差，不能 长 期 表 达，或外源基因容纳性差，载 体 制 备困难，因而应用有限。逆转录病毒属于 RNA 病毒，感染靶细胞后能将外源基因整合到目的细胞的基因组中，从而使外源基因稳定表达。逆转录病毒包装过程相对简单，最大可插入 8 kb 的基因片段，从而能稳定、高效表达，但需要注意的是逆转录病毒只能转染处于分裂期的细胞，对于非分裂期细胞无效[16-17]。相比之下，慢病毒载体对分裂期和非分裂期细胞都有转染效果，且具有转染效率高、可容纳较大外源性基因片段等优点[18]。此外，慢病毒载体介导的永生化基因在靶细胞整合并表达后，能避免基因沉默，实现永生化目的基因在宿主细胞长时间表达，同时具有相对较好的安全性[19]，目前 已 成 为 HUVECs 永生化中介导转染的首选载体。
4 HUVECs 永生化的方法
Edgell 等[20]最早报道建立了能表达内皮细胞特异性标志物的永生化 HUVECs。在我国，永生化 HUVECs 的建立最早见于钱勇和范又[21] 的报道。此外，边昶等[22]也较早报道了利用 hTERT 基因和 SV40LT 抗原基因构建永生化 HUVECs。在 HUVECs 的永生化中，目前通常采用的方式是 hTERT 基因或 SV40LT 抗原基因在逆转录病毒载体或慢病毒载体介导下转染 HUVECs 使其永生化。
4. 1 hTERT 与 HUVECs 永生化 在细胞的增殖、衰亡过程中，端粒酶发挥着重要作用[23-24]。端粒位于真核细胞染色体末端，在稳定细胞染色体及防止染色体末端融合等方面发挥着重要作用。在正常细胞中，端粒随着细胞增殖次数的增加而缩短，当端粒缩短到一定程度后就会失去相应功能，导致染色体降解，细胞增殖会停止并死亡。hTERT 具有逆转录酶活性，能以端粒酶自身 RNA 为模板，逆转录合成端粒 DNA，维持和延长端粒长度，保持细胞染色体稳定，从而增强细胞的增殖能力、延长细胞的生存周期。Wen 和 Mackenzie[25]的研究显示，端粒酶活性的维持是内皮细胞发生永生化的必要条件。与病毒基因等相比，外源性 hTERT 转入靶细胞后，通过重激活端粒酶维持端粒的长度、保持染色体稳定，使细胞保持原有的分化特征而无恶性转变及核型改变，在细胞永生化方面拥有更大的优势和更广阔的应用前景。目前通过 hTERT 介导成功建立的永生化细胞系有内皮细胞、乳腺上皮细胞、前列腺上皮细胞、肺成纤维细胞、神经祖细胞及骨髓基质干细胞等[26-28]。在 HUVECs永生化相关研究方面，杨玉琮等[29]采用逆转 录 病 毒 载 体 PLNC-hTERT 将 hTERT 转 入 HUVECs，G418 筛选后所获得的阳性克隆倍增时间缩短，内皮细胞生存时间延长，但未获得永生化，细胞的形态和功能未发生改变; 端粒酶表达阳性，而阴性对照组细胞端粒酶表达阴性; 与永生化基因偶联的抗性标记 Neo 基因表达阳性，提示外源永生化基因成功与内皮细胞基因组整合并表达; Ⅷ因子阳性表达。Takano 等[30] 采用人类巨细胞病毒载体将 hTERT 转入 HUVECs，G418 筛选出阳性克隆，所获细胞保持内皮细胞源性，端粒酶表达阳性，并稳定表达内皮细胞标志物，如 CD31、激酶插入区域受体、内皮型一氧化氮合酶等，细胞生存周期大大延长。
4. 2 SV40LT 与 HUVECs 永生化 SV40 由结构蛋白[病毒蛋白( viral protain，VP) 1、VP2、VP3]和抗原 ( 大 T 抗原、小 T 抗原) 组 成。SV40LT 同 时 具 有 ATP 酶和 DNA 解旋酶活性，在 DNA 合成诱导及蛋白质合成修饰过程中扮演着重要角色。SV40LT 抗原参与细胞转化的启动，在细胞转化过程中起决定性作用。SV40LT 介导 HUVECs 发生永生化的机制目前尚未完全明确，可能与以下机制有关: ①SV40LT 抗原通过与热激蛋白 70、肿瘤抑制蛋白( pRb、p107、 p130) 以及肿瘤抑制因子 p53 相互作用促进细胞发生转化; ②SV40LT 成功转染细胞后可激活细胞端粒酶并合成端粒，增加端粒长度，从而使细胞保持持续的增殖能力; ③SV40LT 可与生长抑制因子 SEN6 等相互作用[31]; ④永生化上调蛋白家族成员是 SV40 介导的永生化和细胞增殖的核蛋白[32]; ⑤SV40LT 自身具备 ATP 酶和激酶活性等。
目前为止，通过 SV40LT 使细胞发生永生化的方法有以下几种: ①野生型 SV40 与靶细胞共培养，感染靶细胞，从而导致永生化; ②通过磷酸钙沉淀法、脂质体转染法或电击法等将 SV40LT 直接转入靶细胞并表达，使靶细胞发生永生化; ③通过慢病毒或逆转录病毒载体感染宿主细胞并整合表达，使靶细胞发生永生化改变等。
通过 SV40LT 转染细胞进而建立的永生化细胞系有 HUVECs、猪脐静脉血管内皮细胞[33]、牛肝脏窦状 隙 内 皮 细 胞[34] 等。Van Leeuwen 等[35] 将 含 SV40LT 的 基 因 转 入 HUVECs 后 成 功 建 立 了 HUVECs永生化细胞系 EVLC2，细胞端粒酶被激活，上皮细胞黏附分子和 v-W 因子阴性表达，GP96 表达下降。梁淑丽等[11] 通过慢病毒载体介导将含SV40LT 基因的质粒成功转染 HUVECs，所建立的细胞系特异性表达Ⅷ因子，逆转录聚合酶链反应鉴定 SV40LT 在转染后的细胞内呈阳性表达，细胞具备管状成形能力、无限增殖能力，并保持了血管内皮细胞源性。冯海凉等[36]报道，通过感染含有 SV40T 的抗原，HUVECs 大大延长了生命周期，体外传代 40 代以上，并保持了人内皮血管细胞源性，细胞核型正常稳定，裸鼠成瘤实验阴性。
有研究认为，单用 SV40LT 或 hTERT 转染内皮细胞致其永生化的效率相对较低，或只能延长细胞的生存周期但不能使细胞永生化。同一细胞共转染上述两个基因片段发现，SV40LT 抗原可以使细胞绕过 M1 期，延长细胞寿命; hTERT 基因可使细胞端粒保持稳定，使细胞绕过 M2 期，从而提高转染效率和稳定 性[22]。边 昶 等[22] 通 过 构 建 含 有 hTERT 和 SV40LT 的 cDNA 片段的逆转录病毒载体，将 hTERT 和 SV40LT cDNA 片段共同转染 HUVECs，新霉素衍生物和嘌呤霉素抗性培养基培养筛选后所获的阳性克隆细胞中Ⅷ因子、E-选择素以及脂肪酶表达阳性，蛋白质印迹法检测显示 SV40LT 和 hTERT 阳性表达，端粒酶的活性显著增强，保持了 HUVECs 的分化特性，所得永生化 HUVECs 生命周期显著延长，已培养至第 50 代，细胞生长状态良好。
4. 3 其他方法 在 HUVECs 永生化研究中，除用 hTERT 与 SV40LT 基因介导外，还可将某些病毒( 如乳头瘤病毒 E6-E7、疱疹病毒) 或癌基因转入 HUVECs，使其增殖能力显著增强。Rhim 等[37]报道，乳头瘤病毒 E6-E7 基因通过逆转录病毒载体介导转染HUVECs，成功建立了能保持内皮细胞源性、具有无限增殖能力且未出现恶性转化的永生化 HUVECs。Wang 等[38]通过逆转录病毒载体介导将卡波西肉瘤相关疱疹病毒 K1 蛋白基因转染 HUVECs，细胞生命周期延长，经 55 次传代后仍能以正常细胞形态生长，但可出现细胞恶性转换，裸鼠成瘤阳性。Abboud 等[39]将带有卡波西肉瘤相关疱疹病毒 G 蛋白偶联受体的逆转录病毒转入 HUVECs，使得 HUVECs 的生命周期延长。此外，Faller 等[40] 通过构建包含 ras 或 mos 癌基因的小鼠肉瘤病毒载体转染 HUVECs 使其永生化，所获细胞可不依赖人为添加生长因子而增殖，细胞形态和表型不变，Ⅷ因子、W-P 小体表达阳性，细胞内大量表达肉瘤病毒特异性信使 RNA 但无病毒合成活动，能无限增殖并保持了内皮细胞源性。
4. 4 可回复性永生化 上述细胞永生化的方法有效解决了原代细胞获取困难及寿命有限的难题，但仍存在安全性及特异性功能分化较差等缺点。将 SV40LT 等病毒癌基因导入细胞使其发生永生化，永生化基因长期存留在细胞内具有潜在的恶变风险。近年来出现的可回复性永生化技术将条件基因敲除技术 Cre /Loxp 系统与基因转染技术联合起来，诱导细胞发生永生化，细胞增殖能力增强，经扩大培养得到足量的永生化细胞后，利用位点特异性酶将基因组中永生化基因重新切除，从而实现细胞永生化及可控回复性。这项技术既能使细胞无限增殖，又克服了细胞因永生化而发生恶性转变、安全性差的缺点。近年来，可回复性永生化技术日趋成熟和稳定，通过此项技术获得的可回复性永生化细胞系有成纤维细胞、肝细胞、胰岛细胞、神经干细胞、支气管上皮细胞等[41-42]。目前还未有可回复性永生化方法构建永生化 HUVECs 的报道，相信在未来有望将这项技术应用于 HVUECs，从而为内皮细胞永生化的相关研究提供更好的选择性。
5 永生化 HUVECs 的检测
可通过形态学对永生化 HUVECs 进行鉴定: 在倒置显微镜下可见细胞呈单层附壁生长，细胞为梭形或多角形; 透射电镜下可见特征性 W-P 小体[9]; Southern-blot 技术、Northern-blot 技术、免疫细胞化学染色或蛋白质印迹法可用来分析外源性永生化基因在靶细胞基因组中的整合、转录以及表达情况[9，11]; 可利用与外源性永生化基因相关联的标记基因鉴定该永生化基因在宿主细胞基因组的整合情况; 还可通过聚合酶链反应技术对端粒酶基因进行扩增，检测永生化细胞中端粒酶的活性，从而鉴别永生化内皮细胞[22]。免疫细胞化学技术可通过检测细胞表面抗原鉴定永生化 HUVECs。此外，还可采用裸鼠颈部皮下注射是否成瘤来检测永生化 HUVECs是否存在恶性变[37]。
6 结 语
近年来，关于 HUVECs 永生化的研究得到快速发展。可以利用多种细胞永生化方法建立永生化 HUVECs，为血管内皮细胞的相关研究提供了标准的细胞模型和更多的细胞资源。但目前还有很多问题尚待解决，如细胞永生化机制尚未完全明确，细胞表型改变、恶性转化的潜在风险。可回复性永生化技术克服了靶细胞恶变等缺陷，有望为 HUVECs 永生化提供更好的选择。HUVECs 永生化的研究和应用意义重大，有可能为细胞学和医学领域带来突破性进步。
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