【摘要】目的探究氨基葡萄糖盐酸盐(glucosaminehydrochloride，GAH)及其结构相似的衍生物对斑马鱼骨骼损伤的修复作用，并比较GAH与阿仑膦酸钠片对骨骼损伤的预防效果。方法将斑马鱼胚胎暴露在相同浓度下(0.1%，1mg/mL)的GAH，葡萄糖、甘露醇、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺溶液中，观察其对胚胎发育的影响。将枸橼酸铁铵(ferricammoniumcitrate，FAC)诱导的骨质疏松症斑马鱼幼鱼暴露在0.1%的GAH、葡萄糖、甘露醇、半乳糖和N-乙酰葡萄糖胺溶液中，利用茜素红、阿尔新蓝染色法观察骨骼的修复状况。同时，通过茜素红染色法比较GAH与阿仑膦酸钠片(alendronatesodium，AL)对骨质疏松的预防作用。结果相同浓度的不同药物对斑马鱼发育影响的大小依次为葡萄糖<甘露醇
【关键词】氨基葡萄糖盐酸盐;糖类衍生物;骨骼修复;骨骼染色
氨基葡萄糖盐酸盐(glucosaminehydrochloride，GAH)又名葡糖胺盐酸盐，是天然氨基单糖衍生物之一，而氨基葡萄糖是软骨基质中合成蛋白聚糖所必需的重要成分[1-2]。前期的研究结果表明，GAH对斑马鱼骨骼的发育及损伤有明显的促进及修复作用。
而与GAH有类似结构的糖类及衍生物有很多，如:葡萄糖(glucose，Glu);葡萄糖的同分异构体D-半乳糖(D-Galactose，Gal);由葡萄糖的同分异构体甘露糖加氢而得到的甘露醇(manntiol，Man);与GAH类似的氨基糖衍生物N-乙酰葡萄糖胺(Nacetylglucosamine，NAG)[3-5]。本文以斑马鱼为模型，探索比较GAH及其衍生物对斑马鱼幼鱼骨骼损伤修复及预防的效果。
1材料和方法
1.1实验动物
TU品系斑马鱼，由清华大学生命科学学院孟安明课题组惠赠。饲养于本课题组的斑马鱼水循环养殖系统中，斑马鱼的养殖和繁殖参照标准方法[6-7]。将性成熟(3月龄)的雌雄斑马鱼放入交配缸中，插入隔板;次日清晨拨开挡板待交配产卵，斑马鱼胚胎在受精后30min内收集，洗涤后放入90mm培养皿，加入Holfreter水(0.05g/LKCl，0.1g/LCaCl2，0.025g/LNaHCO3，3.5g/LNaCl)培养于28℃恒温培养箱中，在体式显微镜下挑选发育正常胚胎，用于试验。动物实验遵循3R原则。
1.2实验药物及仪器
本研究所用GAH药物是从双孢蘑菇中提取所得，与传统从虾蟹壳来源相比，避免了过敏、呕吐等不良反应，扩大了适用人群。葡萄糖和甘露醇(AMRESCO);D-半乳糖溶液(国药集团);N-乙酰葡萄糖溶液(上海源聚生物科技有限公司);阿仑膦酸钠片(默沙东制药);枸橼酸铁铵(Sigma，F5879-100G)。
AUY320日本岛津电子分析天平(上海仪田精密仪器有限公司);PYX-280-A生化培养箱(科力仪器有限公司);ZD-9550转移摇床(海门其林贝尔);MS-H-S磁力搅拌器(武汉华科达实验设备有限公司);NikonSMZ18体式荧光显微镜(日本)。
1.3实验方法
1.3.1胚胎的药物处理
以6孔板为实验容器，每孔50枚胚胎，根据前期的实验条件及已有的研究报道[8]，选用0.1%(1mg/mL)的工作浓度，将斑马鱼受精后0.75h的胚胎分别暴露在葡萄糖溶液(Glu)、甘露醇溶液(Man)、D-半乳糖溶液(Gal)、N-乙酰葡萄糖胺溶液(NAG)和GAH溶液中，以未加药组即Holfreter水培养为对照，每个处理组至少50枚胚胎，每12h更换一次溶液，同时设置3个平行样。观察斑马鱼胚胎发育到36h的生长状况及死亡情况。
1.3.2阿尔新蓝和茜素红染色
阿尔新蓝染色是一种能够特异性地染色软骨细胞胞外基质的染料，发育生物学研究中一般使用该染色方法检测胚胎骨骼的形成和软骨的发育情况[9-10]。茜素红能与骨骼中钙离子以螯合方式形成复合物，可识别骨的钙盐成分，与骨中的钙结节产生显色反应，因此可用来检测鱼的骨形态和骨密度[11]。阿尔新蓝和茜素红染色方法参照文献[12]。染色完成后，观察斑马鱼骨骼的修复状况，并拍照记录。
1.3.3不同药物对斑马鱼骨质疏松症的修复作用分组
收集48hpf(hourspost-fertilization)的斑马鱼幼鱼，分为对照组(WT，正常的养鱼水培养至第10天);FAC组(500μg/mLFAC培养至第10天);Man组(FAC培养4d，再换成0.1%甘露醇溶液培养4d);Glu组(FAC培养4d，再换成0.1%葡萄糖溶液培养4d);NAG组(FAC培养4d，再换成0.1%N-乙酰葡萄糖胺溶液培养4d)，Gal组(FAC培养4d，再换成0.1%半乳糖溶液培养4d);GAH组(FAC培养4d，再换成0.1%GAH培养4d)，共7组。对培养10d的7组幼鱼进行阿尔新蓝染色和茜素红染色。
1.3.4GAH和阿伦膦酸钠对骨质疏松症的预防作用分组
收集24hpf的斑马鱼胚胎，分成4组，分别为对照组(CTR):正常的养鱼水培养至第10天;CTR+FAC组:先用H2O培养5d，再用500μg/mLFAC培养4d;AL+FAC组:先用0.1%AL培养5d，之后用FAC培养4d;GAH+FAC组:先用0.1%GAH培养5d，再换成FAC培养4d。对培养10d的4组进行茜素红染色。
1.4统计学方法
用体式荧光显微镜观察阿尔新蓝和察茜素红染色的斑马鱼骨骼染色即发育情况，所有的图像均采用相同的光强度和曝光设置。用图像分析软件Imageproplus6.0计算阿尔新蓝染色区域的面积，以反映骨骼的软骨形成量[13]，并计算茜素红染色区域的面积和累积光密度(IOD)，以分别反映骨骼的矿化量和骨密度[14-15];采用SPSS17.0软件进行统计分析，实验数据以平均数±标准差(x珋±s)表示，采用t检验分析组间差异，以P<0.05为差异有显著性。
2结果
2.1相同浓度下不同药物对斑马鱼胚胎发育的影响
与对照组相比，半乳糖与N-乙酰葡萄糖胺溶液的斑马鱼胚胎死亡率最高，且发育有明显的延缓;葡萄糖与甘露醇对斑马鱼胚胎的影响较小，与对照组的死亡率基本相同，发育速度正常;GAH的死亡率为22%，发育正常且一致。总体分析对斑马鱼胚胎发育影响的大小依次为葡萄糖<甘露醇
2.2不同药物对斑马鱼骨质疏松症的修复作用
2.2.1对软骨损伤的修复比较
通过阿尔新蓝染色检测不同处理组的软骨发育状况，与FAC组相比，Man组和Glu组染色基本一致，其骨骼染色没有变化;Gal组和NAG组，在副蝶骨、角舌骨、腭方骨及角鳃骨等部位的染色与Glu组和Man组相比加深，且Gal组比NAG组的染色更深;而GAH组的整个头部骨骼染色明显加深，与对照组较为接近。(图2a～g)
统计分析结果显示，Glu组、Man组、NAG组的染色面积与FAC组相比差异无显著性(P>0.05);Gal组的染色面积显著性增加(P<0.01);GAH组的染色面积极显著增加(P<0.001)，表明GAH对斑马鱼软骨的损伤修复效果最好。(图2h)
2.2.2对硬骨损伤的修复比较
通过茜素红染色观察骨密度及骨形态，结果表明:与FAC组相比，Man组和Glu组的基本一致，染色都在其头部的脊索和匙骨稍有加深;Gal组与NAG组的副蝶骨、角舌骨、麦柯耳软骨及匙骨等部位的颜色比Glu组和Man组深;而GAH组的恢复效果最为显著，整个头部的骨骼染色与对照组接近，并且明显能看到两节脊椎。(图3a～g，)
统计结果显示，与FAC组相比，Glu组、Man组、NAG组的染色面积无显著性差异(P>0.05);Gal组的染色面积显著性增加(P<0.01);GAH组的染色面积极显著增加(P<0.001)。
骨密度的变化趋势与染色面积的变化趋势一致。由此说明，GAH对斑马鱼的骨骼损伤修复效果最好，同时，在后期药物修复的过程中，GAH组死亡率为零，而Gal组与NAG组陆续出现死亡，侧面反映了GAH的药效温和。(图3h～i)
2.3不同药物对骨质疏松症的预防作用
与CTR组相比，其它三组的染色深度有不同程度的减弱。CTR+FAC组中的副蝶骨和脊索的染色信号显著减弱;匙骨、孔盖和鳃条骨等部位的染色区域也明显减小。AL+FAC组的斑马鱼头部染色整体变浅，染色面积也显著减少，且有明显的残留药物(FAC)，只有匙骨、脊索和孔盖可见染色信号。而在GAH+FAC组中的麦柯耳软骨、软骨内成骨、孔盖、鳃条骨、舌骨下颌弓和脊椎骨都清晰可见，尤其是匙骨和脊索的染色强度与对照组非常接近，说明经GAH处理后，可明显减缓FAC引发的骨损伤。(图4)
3讨论
斑马鱼是一种优良的骨骼研究动物模型，它与人类在骨骼发育过程中的基因、信号通路有高度同源性，与其他的动物模型相比，具有个体小适合高通量化学筛选、幼鱼身体透明易于观察骨骼发育的特点，所以近年来以斑马鱼为模型的骨骼研究逐渐成为这一领域的热点[16-17]。斑马鱼的骨骼发育是一个从头到尾的进程，其整个脊椎发育完成需要23d左右。本研究对发育至第10天的斑马鱼幼鱼进行骨骼染色，此时其颅骨已基本形成，脊椎应发育至第9脊椎，当用药物(FAC)处理后，本该在此时期形成的骨骼出现缺失，导致一系列检测指标下调，与Zhang等[18]报道的骨质疏松症表型一致。
实验结果表明，对斑马鱼胚胎发育影响的大小依次为:葡萄糖<甘露醇
GAH对FAC引起的损伤有一定的预防作用，优于阿仑膦酸钠片。同时，在AL+FAC组处理过程中出现了较高的死亡率，且后期染色有明显残留物，说明在正常状态下服用阿仑膦酸钠，不仅不能起到预防骨质疏松的作用，反而对正常的机体有损害，此结果为未来GAH作为保健品开发，用于骨质疏松预防提供了初步的实验支撑。
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