摘要:在已知地黄磷酸丙糖异构酶(RgTPI)基因少量片段的基础上，采用电子克隆技术克隆出RgTPI基因的完整开放阅读框(ORF)，并进行生物信息学分析，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法分析其空间表达模式，为进一步研究其在糖酵解过程中的作用及其他功能的开发应用奠定基础。结果表明，克隆得到的RgTPI基因完整ORF序列全长为765bp，编码254个氨基酸，该序列与芝麻和猴面花等植物中的TPI基因有较高的同源性。经预测发现，RgTPI为稳定的亲水性蛋白，属于ICL-KPHMT超家族的成员。该蛋白中α螺旋占46.06%，无规卷曲占28.35%，延伸链占16.93%，β转角占8.66%，是一种转移酶，没有跨膜运输功能，不是分泌性蛋白，大多存在于线粒体中。qRT-PCR结果表明，RgTPI在地黄叶中的表达量明显高于根和茎。
关键词:地黄;磷酸丙糖异构酶基因;RgTPI基因;生物信息学分析;空间表达
磷酸丙糖异构酶(Triosephosphateisomerase，TPI或TIM)被发现于植物、虫类、真菌等几乎全部的生物个体中，能够催化磷酸二羟丙酮(DHAP)和D型3-磷酸甘油醛(GAP)，用于磷酸丙糖异构体之间的可逆转换[1]，在糖酵解和脂肪酸合成等途径中具有非常重要的作用。目前，TPI基因在部分生物如玉米[2]、龙眼[3]、草菇[4]、松墨天牛[5]等中已相继被克隆。研究表明，草菇TPI基因表现出异核体表达的协同增效作用;在克氏原螯虾体内TPI是一种新型过敏原，能够引起机体的过敏反应;通过蛋白质组学分析，Salekdeh等[6]发现，在干旱胁迫下水稻TPI基因的表达量显著上升。地黄(Rehmanniaglutinosa)是“四大怀药”之一，属于玄参科地黄属多年生草本植物，主要以块根入药，是一种重要的传统中药药材。地黄种类繁多，一般分为鲜地黄、生地黄和熟地黄。其中，鲜地黄具有清热生津、凉血止血功效，生地黄具有养阴生津的功效，而熟地黄具有滋阴补血、益精填髓的功效。目前，地黄中的一些基因已被报道，主要有地黄扩展蛋白基因RgExpA1[7]、RgEXPA10[8]，纤维素合酶基因[9]，液泡质子泵焦磷酸水解酶基因RgVP和3-酮酯酰CoA-硫解酶基因RghKAT、RglKAT[10]，与B12D基因同源的未知功能基因RghBNG[11]，酪氨酸脱羧酶基因[12]，牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因RgGGPPS1[13]、RgGGPPS2[14]，PR蛋白基因RGPR-10[15-16]，1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因RgDXR[17]，但尚未见RgTPI基因的克隆及空间表达研究。为此，基于已有的部分RgTPI基因片段，采用电子克隆的方法获得绝大部分cDNA序列和全长开放阅读框(ORF)序列，并对其进行生物信息学及空间表达分析，为进一步研究其在糖酵解过程中的作用及其他功能的开发应用奠定基础。
1材料和方法
1.1材料
供试地黄品种为温85-5，其块根种植于河南师范大学试验田。RgTPI基因380bp片段由河南师范大学植物遗传实验室提供。
1.2方法
1.2.1绝大部分RgTPIcDNA及ORF全长序列的克隆基于已有的380bpRgTPI基因片段，利用在线NCBI中的Blast及DNAMAN软件进行一系列的同源比对、移除和拼接，最终获得绝大部分的RgTPIcDNA序列。利用ORFfinder获得基因序列的ORF(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)，最终得到RgTPI基因完整的ORF序列片段。
1.2.2RgTPI基因的生物信息学分析利用软件DNAMAN进行RgTPI基因的同源性比对，采用软件DNAstar中的Megalign绘制系统进化树，利用软件Protparam分析蛋白质理化性质，采用软件SignalP4.1Server进行信号肽分析[18]，采用软件TMHMMServerv.2.0进行跨膜结构域分析，利用NCBI的ConservedDomainDatabase数据库分析保守结构域，利用软件Polarity/Grantham分析蛋白质极性，利用软件Expasy中的SOPMA预测蛋白质二级结构、CPHmodels预测三级结构，利用在线软件Cbs中的Protfun预测基因功能，利用在线软件Cbs中的NetPhos3.1预测磷酸化位点，利用在线网址https://www.genscript.com/psort.html进行亚细胞定位。
1.2.3RgTPI基因的组织特异性表达分析利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测RgTPI基因在地黄根、茎、叶中的表达情况。RgTPI基因引物序列为F:5'-TCGGCGGCAACTGGAAATG-3'，R:5'-ATGAAAATCAGGTCGCAGAGAACTT-3'，引物序列合成于英潍捷基(上海)贸易有限公司，产物长164bp。以TIP41基因(引物F:TGGCTCAGAGTTGATGGAGTGCT，R:CTCTCCAGCAGCTTTCTCGGAGA)作为内参基因。qRT-PCR反应体系见表1。qRT-PCR扩增程序:95℃预变性3min;95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环;72℃终延伸5min。采用2-ΔΔCt分析方法对RgTPI基因进行相对表达量分析。
2结果与分析
2.1RgTPI基因的克隆及序列分析
经克隆获得871bp的部分RgTPI基因cDNA序列，其中，ORF为765bp(86—850)，编码的蛋白质共有254个氨基酸残基(图1)。运用在线软件NCBI及DNAMAN分别进行氨基酸多重序列比对分析(图2)，RgTPI氨基酸序列与其他部分相似性植物物种的总同源性为75.37%，这些物种包括芝麻(Sesamumindicum)、猴面花(Mimulusguttatus)、甘蔗(Saccharumofficinarum)、大豆(Glycinemax)、大麦(Hordeumvulgare)、黄连(Coptisjaponica)、烟草(Nicotianatabacum)、蜈蚣草(Pterisvittata)、芜菁(Brassicarapa)、陆地棉(Gossypiumhirsutum)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)和稻(Oryzasativa)。其中，与地黄亲缘关系最近的是芝麻和猴面花，同源性分别为98.43%和96.85%，与蛋白核小球藻的亲缘关系最远，同源性仅为56.75%。
基于TPI氨基酸序列的地黄及其近缘物种的系统进化分析结果(图3)与DNAMAN一致，与地黄亲缘关系最近的是芝麻和猴面花，率先聚为一支，后与烟草、拟南芥和芜菁聚在一起成为一支，与蛋白核小球藻的亲缘关系最远。通过NCBI检索得出，芝麻和猴面花的TPI基因的ORF大小也均为765bp，间接说明本研究克隆的RgTPI基因ORF序列正确。
2.2RgTPI基因功能、结构域预测
经预测，RgTPI蛋白分子式是C1228H1931N327O364S7，等电点(pI)是5.52，相对分子质量为27324.23，带负电的氨基酸残基总数(Asp+Glu)为29个，带正电的氨基酸残基总数(Arg+Lys)为25个，平均亲水性系数为0.024，预测为亲水性蛋白。理论上推导其半衰期为30h，不稳定指数为24.12，属于稳定蛋白。该基因编码的相应蛋白质中，缬氨酸(Val)所占的比例最多，为13.4%;其次为丙氨酸(Ala)，为10.2%。
经特定匹配得出，RgTPI蛋白属于ICL-KPHMT超家族，即是ICL-KPHMT超家族成员(图4)。RgTPI基因主要存在于线粒体内，还可能存在于细胞核和细胞质内(表2)。对RgTPI蛋白的极性进行预测发现，RgTPI蛋白极有可能是亲水性蛋白(图5)，这与前面RgTPI蛋白理化性质的预测结果一致。软件分析发现，RgTPI蛋白跨膜螺旋结构数目为0，即该蛋白没有跨膜螺旋结构，推测其极有可能在细胞内发挥相应的功能，这与亚细胞定位结果一致。
由表3可知，RgTPI蛋白无信号肽，说明其不是分泌性蛋白，也表明其极有可能在细胞内参加某些反应。对RgTPI蛋白进行功能预测(表4)发现，该蛋白是一种酶，且是转移酶。
RgTPI蛋白磷酸化位点进行预测(图6)发现，其磷酸化位点有14个丝氨酸(Ser)、12个苏氨酸(Thr)和5个酪氨酸(Tyr)。
2.3RgTPI蛋白二级结构、三级结构的预测
蛋白质的二级结构为蛋白质多肽链折叠产生的由氢键维系的规则构象[19]。蛋白质三级结构是蛋白质在已有的二级结构基础上进一步折叠的三维构象形式。三级结构主要依靠氨基酸侧链基团之间的次级键来维持，一个特定蛋白质的功能由蛋白质的空间结构和构象决定[20]。对RgTPI蛋白二级结构及三级结构(图7)进行预测发现，RgTPI蛋白中α螺旋最多，占46.06%;其次是无规卷曲，占28.35%;延伸链占16.93%;β转角占8.66%。
2.4RgTPI基因组织特异性表达分析
由图8可知，RgTPI基因在地黄根、茎、叶中均表达，在叶中表达量最高，茎、根中微量表达，即表达量表现为叶>茎>根。
3结论与讨论
本研究克隆所得RgTPI基因ORF长765bp，编码254个氨基酸残基。经预测发现，RgTPI蛋白为亲水性蛋白;其半衰期为30h，属于稳定蛋白;该蛋白属于ICL-KPHMT超家族成员;该蛋白与芝麻、猴面花TPI蛋白的同源性较高，分别为98.43%、96.85%;该蛋白不含信号肽，说明其不能跨膜运输，不是分泌蛋白，极有可能在细胞内参加某些反应;RgTPI基因大多存在于线粒体中。RgTPI基因在地黄叶中表达量最高，茎、根中微量表达，推测该基因在地黄中尤其在叶的分化及发育过程中起重要作用。本研究针对地黄糖酵解过程中的RgTPI蛋白进行了生物信息学分析，填补了地黄基因库的研究空缺，为进一步加快探索RgTPI基因功能提供了一定的理论信息和科学依据，为进一步研究其在糖酵解过程中的作用及其他功能的开发应用奠基了基础。
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