摘要:目的测定四逆散冻干粉中2种主要成分的含量。方法色谱条件:KromasilC18柱(4.6mm×250mm，5μm)，流速1.0mL·min-1，柱温28℃，流动相A为乙腈;流动相B为磷酸水(pH=3)，流动相A梯度洗脱(95%～75%乙腈)，分析时间为20min。用高效液相色谱(HPLC)法测定主成分的含量。结果四逆散中芍药苷为2.41%、柴胡皂甙C为2.33%。结论用HPLC法测定四逆散中主要化学成分的含量，操作简单，可靠，重现性好，可作为四逆散药材质量控制的有效方法。
关键词:四逆散;主要有效成分;高效液相色谱;质量
四逆散为东汉张仲景《伤寒论》首载，由柴胡、白芍、枳实、甘草四味药物组成。四逆散冻干粉在改善与提高睡眠质量方面具有独特的疗效[1]。但对其改善睡眠作用的药效物质基础研究国内外尚未见报道。芍药苷与柴胡皂苷C是四逆散全方抗炎和免疫抑制药效的主要效应成分[2]。且这2种成分在按照复方中比例同时联合给药时，表现出显著的药效协同作用[3]。本实验用HPLC方法，对四逆散中2种主要化学成分(芍药苷和柴胡皂苷C)含量进行了测定。
材料与方法
1药品、试剂与仪器
柴胡，产地:陕西，购于河北省安国市康信义药材行;白芍，产地:杭州;枳实(炙)，产地:福建;甘草(炙)，产地:内蒙古，均购于哈尔滨市世一堂中药饮片厂，以上药材经黑龙江中医药大学生药学教研室都晓伟教授鉴定符合2015版《药典》规定;柴胡皂苷C，含量>98%，批号:0900-200609，成都思科华生物技术有限公司生产;芍药苷，含量>98%，批号:110736-200611，由中国食品药品检定研究院提供。乙腈、甲醇，均由美国迪马试剂公司生产;磷酸，北京益利精细化学品有限公司生产。
2010-A高效液相色谱仪，日本岛津公司产品;B3200S-T超声震荡仪，必能信超声上海有限公司产品。
2实验方法
2.1色谱条件[4]
HypersilC18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm;中国科学院大连物理化学研究所);KromasilC18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm，大连依利特分析仪器有限公司);LichrosorbRP18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，这3种色谱柱对同一样品进行分析。柱温30℃，流速1mL·min-1，检测波长:200～400nm。梯度洗脱程序:0～150min，乙腈10%～90%，水90%～10%。梯度洗脱系统:①甲醇-水;②乙腈-水;③乙腈-0.05%磷酸，对同一样品进行梯度洗脱系统分析。
2.2最佳检测波长选择
用二级管阵列检测器进行全波长紫外扫描，在不同波长下获取数据。
2.3提取方法考察
对乙酸乙酯、水饱和正丁醇和氯仿进行萃取的不同浓度、不同溶剂和超声时间进行了考察。
2.4溶液制备[5-6]
对照品精密称取芍药苷0.54mg、柴胡皂苷C0.62mg，分别置于5mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，备用。
供试品称取组成四逆散四味药材的冻干粉0.45g，置容量瓶中，加入75%甲醇20mL，超声提取45min，冷却，摇匀，滤过，再过0.45μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
2.5线性关系考察[7]
吸取上述对照品溶液，进样量分别为2，4，6，8，10μL，建立以成分含量为横坐标、峰面积为纵坐标的标准曲线方程。
2.6方法学考察[8]
精密度实验吸取供试品溶液10μL，连续进样6次，测定芍药苷和柴胡皂苷C的峰面积积分值。
重现性实验按“供试品溶液的制备”方法，分别制备6份供试品溶液，各吸取10μL进样测定。
稳定性实验取供试品溶液在上述色谱条件下，分别在0，6，12，24，36，72h各进样10μL，测定芍药苷和柴胡皂苷C的峰面积积分值。
回收率实验采用加样回收测定法。称取已知含量的样品共6份，分别加入一定量的芍药苷、柴胡皂苷C对照品，制备样品6份，进样量10μL，进行HPLC测定。
结果
1实验条件的确定
色谱柱大连依利特分析仪器有限公司KromasilC18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)在分析本样品时，出峰较多，峰形较好，故该色谱柱被采用。
洗脱系统乙腈-0.05%磷酸梯度洗脱吸收峰数目多，峰形好，故选用该流动相系统。
最佳检测波长240nm色谱图的色谱峰数目最多，且各峰响应值较高，各色谱峰相互之间分离度较好，基线平稳，故检测波长定为240nm;同时，柴胡中主要化学成分为柴胡皂苷a及柴胡皂苷d，两者在203nm处有最大吸收，但在此波长下基线漂移较为严重，在210nm下检测两者响应值与203nm处相比略有减小，而基线相对平稳，所以在建立指纹图谱的过程中，采用240，210nm双波长检测。
最终确立的色谱条件色谱柱:KromasilC18柱(4.6mm×250mm，5μm;大连依利特分析仪器有限公司);流动相:乙腈-0.05%磷酸水梯度洗脱(0～25min，95%～75%乙腈);检测波长:210nm;流速:1.0mL·min-1;柱温:28℃。
2方法学评价
2.1提取方法
70%甲醇20mL超声处理40min所得样品的出峰数目最多，干扰峰少，分离度好，响应值高。
2.2线性关系
芍药苷在0.21～1.24μg、柴胡皂苷C在0.08～0.52μg内线性关系良好。
2.3精密度
芍药苷和柴胡皂苷C的含量RSD分别为1.75%和1.22%，小于3%，符合要求。
2.4重现性
芍药苷和柴胡皂苷C的含量RSD分别为1.44%和1.28%，小于3%，符合要求。
2.5稳定性
芍药苷和柴胡皂苷C的含量RSD分别为1.85%和1.42%，小于3%，符合要求。
2.6回收率
测得芍药苷和柴胡皂苷C的平均回收率分别为99.96%和99.05%，RSD分别为1.45%和1.72%，表明本方法的回收率高。
3四逆散药材中主要成分含量
测得在四逆散药材中的芍药苷含量为2.41%，柴胡皂苷C为2.33%，见图1。
讨论
四逆散的有效成分不明与化学成分复杂，但组成四逆散的各单味药的化学成分基本清晰。为此，本实验结合其主要化学成分含量测定，来控制四逆散的质量，保证供试样品质量的恒定。
本实验结果表明:本文建立的HPLC法精密度、重现性、稳定性良好，回收率高;操作简单，可靠，重现性好，可作为四逆散药材及四逆散冻干粉质量控制的有效方法。
本实验用RP-HPLC方法测定了四逆散中2种主要化学成分(芍药苷和柴胡皂苷C)的含量，为中药复方四逆散的药效物质基础及机制的研究提供了可靠的方法依据。
高效液相色谱法测定四逆散冻干粉中主要有效成分相关期刊推荐：《中国临床药理学杂志》是于1985年由国家科委批准、中国药学会主办、北京大学临床药理研究所承办、由韩启德院士为主编的向国内外公开发行的全国一级学术刊物，也是我国中文核心期刊之一。本刊主要报道我国临床药学及相关领域的新成果、新技术、新方法，有关临床用药的基础研究，合理用药、药物不良反应、药物相互作用、药物动力学、血药浓度监测以及有关医院药学学科的研究成果与实践。
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