摘要背景：课题组前期的研究中发现，丝素蛋白-壳聚糖支架材料复合诱导后骨髓间充质干细胞在兔体内能修复缺损的软骨组织，但对于该组织工程化软骨组织的生物相容性还未进一步研究。目的：研究丝素蛋白-壳聚糖支架材料复合骨髓间充质干细胞在体内构建组织工程化软骨的生物相容性。方法：使用丝素蛋白-壳聚糖按1∶1比例混合制备三维支架材料，提取兔骨髓间充质干细胞，将诱导后的骨髓间充质干细胞与丝素蛋白-壳聚糖支架构建修复体，再将修复体移植到兔关节软骨缺损模型中修复软骨组织。实验分为3组，实验组植入诱导后骨髓间充质干细胞+丝素蛋白-壳聚糖支架，对照组植入丝素蛋白-壳聚糖支架干预，空白组未植入修复体。结果与结论：①实验成功制备丝素蛋白-壳聚糖三维支架材料及提取骨髓间充质干细胞，并构建软骨缺损的修复体，将修复体植入兔体内能成功修复缺损的软骨组织;②建模后2，4，8，12周，3组血常规、降钙素原、血沉、C-反应蛋白结果提示无明显的全身感染征象，3组血常规及肝肾功能各时间段比较差异无显著性意义(P>0.05);③一般观察、苏木精-伊红染色及扫描电镜观察：建模后12周，相比其他两组，实验组软骨缺损已修复，支架材料已吸收，修复组织周围未见炎性细胞，修复组织已正常组织整合良好;④结果证实，丝素蛋白-壳聚糖支架复合骨髓间充质干细胞在体内构建的组织工程化软骨具有良好的生物相容性。
关键词：丝素蛋白;壳聚糖;骨髓间充质干细胞;组织工程;生物相容性;支架材料;种植体;软骨缺损;软骨修复;体内实验
0引言Introduction
随着人口老龄化的不断加剧及意外事故的发生率不断增加，老年性关节软骨退行性变及损伤性软骨缺损患者逐渐增多[1-2]，由于成人软骨几乎不能自我修复，故目前临床上对于该类患者的治疗存在巨大的挑战。随着患者疼痛症状的加重及功能出现障碍，部分患者最终的治疗方案将会选择关节置换或关节融合[3-4]。自软骨组织工程的出现，让软骨组织的修复成为可能[5]。丝素蛋白和壳聚糖均为天然的高分子材料，有研究证实二者均可以作为种子细胞载体修复软骨组织[6-8]，但二者单独作为支架材料存在不足，如干燥时易碎裂、降解较慢等[9]，因此课题组在前期的研究中发现，将二者按一定比例混合后制备的丝素蛋白-壳聚糖支架材料复合诱导后骨髓间充质干细胞在兔体内能修复缺损的软骨组织[10]，但对于该组织工程化软骨组织的生物相容性还未进一步研究。
因此，为修复缺损的软骨组织，同时检测组织工程修复体在体内的生物相容性，提供组织工程修复体在体内的安全性评估，该实验在前期研究的基础上，进一步观察丝素蛋白-壳聚糖复合骨髓间充质干细胞构建的修复体在体内的生物相容性，为组织工程修复软骨组织应用于临床提供动物实验依据。
1材料和方法Materialsandmethods
1.1设计随机对照动物实验。
1.2时间及地点于2016年3月至2018年12月在贵州省人民医院中心实验室和遵义医科大学中心实验室完成。
1.3材料
1.3.1实验动物健康二三月龄新西兰大白兔，雌雄不限，体质量(2.5±0.2)kg，实验已经过贵州省人民医院动物伦理委员会批准，伦理审批号：伦审[2015]2-009号。实验动物的操作及处置过程经贵州省人民医院学术委员会审查，该项目操作遵循国际及国家颁布的有关生物医学及实验动物伦理要求。
1.3.2实验中使用的生物材料见表1。
将丝素蛋白与壳聚糖以1∶1比例混合，分别在搅拌器中充分混匀，倒入预制的模型中，-80℃冰箱中冷冻，然后用冷冻干燥机抽干水分干燥得到丝素蛋白-壳聚糖三维支架[11]。
1.4实验方法
1.4.1抽取兔骨髓间充质干细胞进行分离、培养及诱导[12]取新西兰大白兔骨髓腔细胞进行分离及培养，将培养的细胞用细胞流式进行干细胞的鉴定[13]。将鉴定为骨髓间充质干细胞的第3代细胞用诱导液(质量浓度10μg/L转化生长因子β1、40μg/L地寒米松、50μg/L抗坏血酸、体积分数10%胎牛血清、HG-DMEM)进行细胞向软骨方向诱导。
1.4.2诱导后骨髓间充质干细胞复合丝素蛋白-壳聚糖支架材料构建修复体将丝素蛋白-壳聚糖支架材料制备成直径为5mm，高为3mm的圆柱体、灭菌。收集第3代经诱导后细胞调整细胞浓度为1.5×1011L-1，接种在经培养基浸泡过的支架上，置于细胞培养箱中培养备用;并用扫描电镜观察细胞在支架材料的生长情况[14]。
1.4.3动物模型的制备及细胞支架修复体修复兔膝关节软骨缺损将54只新西兰大白兔随机分为3组，每组18只，实验组：软骨缺损模型植入诱导后骨髓间充质干细胞+丝素蛋白-壳聚糖支架，对照组：软骨缺损模型植入丝素蛋白-壳聚糖支架，空白组：软骨缺损模型未植入修复体。
造模方法：用体积分数0.7%戊巴比妥钠溶液6mL/kg经耳缘静脉麻醉动物，消毒铺单后，取右膝关节内侧纵切口约2cm，将髌骨向外侧脱位，暴露髌股关节的股骨面，制备一个直径约5mm，深度约3mm的圆形全层软骨缺损[15]，将细胞支架修复体和单纯支架分别植入实验组和对照组，分层缝合切口，术后预防感染。
1.4.4术后指标观察各组分别在建模后2，4，8，12周经耳缘静脉抽取兔外周血进行血常规、肝肾功能、降钙素原、血沉及C-反应蛋白等相关指标检测，检测方法采用全自动生化仪检查，主要观察兔全身炎性反应情况，肝肾功能检测主要观察修复体植入体内后有无肝肾功能损害表现。各组分别在建模后2，4，8，12周抽取修复关节的关节液进行白细胞、脓细胞观察，观察修复体植入体内后局部有无炎性反应，检测方法在显微镜下观察，采用每高倍镜下有多少细胞为计算标准。各组分别在建模后12周麻醉后取材，取材范围为截取缺损修复处及周围正常软骨组织的股骨远端，进行大体观察，观察修复组织的形态、颜色及与周围正常组织整合情况;修复组织进行切片苏木精-伊红染色及扫描电镜观察，观察修复组织的组织学特性、周围炎性反应、支架残留、修复组织与正常组织的整合情况。
1.5主要观察指标骨髓间充质干细胞的分离、培养及诱导;观察干细胞在支架材料的生长情况;建模后2，4，8，12周对实验动物外周血的血常规、肝肾功能、降钙素原、血沉及C-反应蛋白水平等项目进行检测，实验动物关节液白细胞及脓细胞检测，建模后12周取材进行修复组织大体观察、修复组织切片后苏木精-伊红染色及扫描电镜观察。
1.6统计学分析结果采用SPSS19.0统计软件包进行处理分析，数据符合正态分布，所得数据为计量资料以x_±s表示，组间差异比较采用单因素方差分析和LSD检验，以P<0.05为差异有显著性意义。
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2结果Results
2.1实验动物数量分析纳入兔54只，实验过程中无死亡，有1只兔切口发生感染，经早期抗感染后治愈，最终进入结果分析54只。
2.2细胞鉴定结果从兔骨髓腔内抽取的细胞通过分离、培养，经鉴定为骨髓间充质干细胞，见图1，并对其进行扩增和诱导。
2.3丝素蛋白-壳聚糖三维支架材料形态将诱导后的第3代骨髓间充质干细胞成功接种在丝素蛋白-壳聚糖三维支架材料上进行共培养，细胞在支架材料上生长及分裂良好，见图2。
2.4兔血生化指标变化将骨髓间充质干细胞与丝素蛋白-壳聚糖三维支架材料构建的修复体移植到兔膝关节软骨缺损模型进行软骨修复;修复体植入兔关节软骨缺损模型后，分别在建模后2，4，8，12周经耳缘静脉抽取3组兔外周血进行血常规、肝肾功能、降钙素原、血沉及C-反应蛋白水平等相关指标的检测，结果比较差异均无显著性意义(P>0.05)，见表2-4。
各组在干预后2，4，8，12周抽血查降钙素原结果均为阴性(<0.05μg/L)，血沉和C-反应蛋白结果也均为阴性。各组进行修复膝关节腔抽取关节液白细胞、脓细胞进行检测，其结果均为阴性(0/HP)。
2.5各组缺损部分组织学形态变化干预后12周修复组织大体观：实验组软骨缺损处已修复，与周围正常软骨连接良好;对照组修复组织表面不规则，与周围正常软骨界限模糊;空白组软骨缺损处修复不良，缺损处仍有凹陷。
干预后12周修复组织苏木精-伊红染色：实验组缺损处由透明软骨组织修复，与周围正常组织连良好，见软骨陷窝，未见炎性细胞及支架材料，见图3A;对照组软骨缺损处见少许软骨组织修复，未见炎性细胞及支架材料，见图3B;空白组缺损处由纤维样组织填充，见图3C。2.6干预后12周修复组织超微结构变化扫描电镜观察显示，实验组修复组织见软骨细胞及胶原纤维，见图4A;对照组见大量的纤维组织填充，见图4B;空白组缺损处见排列紊乱的纤维组织，见图4C。
2.7生物相容性分析见表5
3讨论Discussion
生物相容性是组织工程支架材料至关重要的因素，它决定着组织修复成功与否的关键[16-17]。目前检测相容性的方法是将支架材料与种子细胞在体外共培养，检测支架毒性、细胞活性、细胞增殖情况及细胞与支架的黏附情况等指标，该方法具有客观性强、可重复性强、影响因素相对简单及敏感性高等特点[18-19]。由于体外培养的组织工程修复体最终需在体内复杂环境因素影响下进行修复缺损的软骨组织，因此评估修复体在体内的生物相容性更有意义[20-21]。目前在体外实验检测支架的相容性报告较多[22-24]，但将种子细胞接种在支架材料上植入体内检测其生物相容性的报告较少，因此实验利用体内实验检查组织工程的生物相容性，为评估组织工程在体内应用的安全性提供实验依据。
丝素蛋白和壳聚糖均是天然材料，大量的研究表明，单独将丝素蛋白或壳聚糖作为支架材料具有良好的细胞生物相容性[25-28]。实验小组在前期的研究中已成功制备出符合软骨组织工程研究的丝素蛋白-壳聚糖三维支架材料，经检测其具有合适的孔径、高孔隙率等良好的理化性质[29]，符合支架材料三维结构与细胞黏附和生长的要求，同时该支架材料在体外具有良好的细胞相容性[30]，且将骨髓间充质干细胞与丝素蛋白-壳聚糖支架材料构建的修复体在兔体内能很好地修复缺损的软骨组织，但该修复体在体内的组织相容性未进一步研究，故实验在前期研究的基础上探讨丝素蛋白-壳聚糖支架复合骨髓间充质干细胞体内构建组织工程化软骨生物相容性。从实验的血常规、降钙素原、血沉及C-反应蛋白检测结果来看，丝素蛋白-壳聚糖支架复合骨髓间充质干细胞构建的修复体在体内无明显急慢性炎症反应;从肝肾功能检测结果来看，实验组与对照组均未发生肝肾毒性反应，说明该修复体具有体内安全性;为减少术后2周内因手术创伤引起的血常规、降钙素原、血沉及C-反应蛋白的变化，实验从修复体植入体内后2周开始取材，故2周前兔的全身炎性反应及肝肾功能改变实验结果无法准确反应，下一步的研究将提前检测时间及增加检测点。通过12周的监测，血常规、肝肾功能实验组与对照组均未见明显改变，说明该修复体长期植入后对动物的肝、肾功能无影响，材料对动物机体没有产生慢性毒性及慢性炎症反应。从兔关节腔积液检查结果来看，关节腔积液未检查出白细胞及脓细胞，说明修复体植入体内后局部无明显的炎症反应，可能因手术创伤导致兔膝关节滑膜损伤或兔个体差异，少部分实验动物关节液较少，需注射少量生理盐水稀释后抽取关节液，故部分实验数据可能存在误差。
组织工程生物材料植入体内对宿主的影响是一个复杂多变的演变过程[31]，其有4种表现：周围组织变性坏死，说明植入的修复体生物材料存在毒性;植入物被周围组织吸收，说明材料可降解且无毒性;植入物被周围组织形成包膜包裹，说明植入材料具有生物惰性;植入物与周围正常组织连接紧密、有机结合一起，说明材料无毒性且有良好的生物相容性[32-34]。从兔骨髓中提取的骨髓间充质干细胞在诱导因子的诱导下能向软骨细胞方向分化，将诱导后的细胞接种在支架材料上细胞生长分裂良好，且在前期的实验中也发现，该支架材料具有无毒、具有一定生物力学，可作为种子细胞的载体。修复体植入体内12周通过取材行大体观察、切片苏木精-伊红染色检测、扫描电镜观察，从结构可以看出，实验组12周时缺损的软骨组织已被透明软骨组织修复，修复面光滑，修复组织与周围正常组织能很好地有机结合，软骨修复厚度与正常软骨厚度基本一致，未见支架材料残留及炎性细胞浸润，说明丝素蛋白-壳聚糖支架复合骨髓间充质干细胞构建的修复体在体内有良好的组织相容性。对照组12周是缺损处主要以纤维组织修复为主，可见许软骨样组织修复，但修复组织光滑度、大体组织抵抗性明显低于正常软骨组织，与周围组织整合稍差，未见支架材料残留及炎性细胞浸润，说明支架材料在体内无毒性且可降解。
课题组在前期的研究中发现，丝素蛋白-壳聚糖支架材料具有良好的细胞相容性，且该支架材料能作为种子细胞骨髓间充质干细胞的载体在体内很好的修复缺损的软骨组织。实验经过进一步研究发现，丝素蛋白-壳聚糖支架复合骨髓间充质干细胞构建的修复体在体内具有良好的生物相容性，为丝素蛋白-壳聚糖支架复合骨髓间充质干细胞构建组织工程修复软骨组织提供动物实验依据。但由于实验观察时间为12周，相对较短，对于种植体在体内长期的不良反应及晚期的致畸致癌相关性还有待进一步研究，且对于已修复的软骨组织生物力学及耐磨性仍需进一步观察。
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