摘要背景：如何调控牙髓干细胞分泌血管内皮生长因子，对于牙髓干细胞促进牙髓再生，尤其是促进牙本质再生、牙髓内血管形成及神经再生等方面具有重要意义。目的：综述影响牙髓干细胞分泌血管内皮生长因子的因素，以期为牙髓再生及临床其他领域的应用提供思路。方法：检索PubMed数据库、万方数据库、CNKI中国期刊全文数据库收录的相关文献。英文检索词为中文检索词为“血管内皮生长因子;牙髓干细胞;牙髓再生;缺氧;炎症因子;细菌毒力因子;生长因子;材料”，最终纳入56篇文献进行归纳总结。结果与结论：血管内皮生长因子是血管生成及血管新生过程中最重要的一类细胞因子，可促进干细胞的增殖、分化，且具有保护神经与促进神经再生的作用。牙髓干细胞是牙髓组织中最主要的干细胞，同时也是牙髓再生中重要的种子细胞，具有高度增殖、自我更新及多向分化等生物学特性以及一定的分泌活性，可作为外源性血管内皮生长因子的替代来源。牙髓干细胞的细胞因子分泌活性受多种因素的影响，如缺氧、细菌毒力因子、炎症因子、生长因子及材料等均可影响牙髓干细胞表达及分泌血管内皮生长因子，因此，调控牙髓干细胞表达及分泌血管内皮生长因子使其更好地应用于牙髓再生成为目前研究的重点。
关键词：血管内皮生长因子;牙髓干细胞;牙髓再生;缺氧;炎症因子;细菌毒力因子;生长因子;生物材料
0引言Introduction
血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)是血管生成及血管新生过程中最重要的一类细胞因子，可促进干细胞增殖、分化，且具有保护神经与促进神经再生的作用。由于血管内皮生长因子半衰期短，外源性血管内皮生长因子需通过复杂的控释系统进行缓慢释放，限制其临床应用。牙髓再生是采用组织工程原理实现受损牙髓以及根尖周组织再生与修复的一种生物学手段，目前牙髓再生的核心步骤包括牙髓血运重建、牙本质再生及神经再生等，而血管内皮生长因子有望为这些问题提供新的治疗途径。牙髓干细胞是牙髓再生中重要的种子细胞，也是牙髓组织中最主要的干细胞，具有高度增殖、自我更新及多向分化的生物学特性及一定的分泌活性，有望成为外源性血管内皮生长因子的替代来源[1]。牙髓干细胞的细胞因子分泌活性受多种因素的影响，一些因素如缺氧、细菌毒力因子、炎症因子、生长因子及材料等均可影响牙髓干细胞表达及分泌血管内皮生长因子，因此，如何调控牙髓干细胞表达及分泌血管内皮生长因子使其更好地应用于牙髓再生成为目前研究的重点。文章将综述血管内皮生长因子及其在牙髓再生中的作用、牙髓干细胞的分泌活性，着重探讨牙髓干细胞表达分泌血管内皮生长因子的影响因素。
1资料和方法Dataandmethods
1.1资料来源第一作者于2018年12月应用计算机在PubMed数据库、万方数据库及CNKI中国期刊全文数据库检索1999年7月至2018年12月相关文献，以“vascularendothelialgrowthfactor;dentalpulpstemcell;dentalpulpregeneration;hypoxia;inflammatorymediator;bacterialvirulencefactor;growthfactor;material”为英文检索词，以“血管内皮生长因子;牙髓干细胞;牙髓再生;缺氧;炎症因子;细菌毒力因子;生长因子;材料”为中文检索词。检索文献类型：综述性论文、研究性论文及著作等。
1.2纳入与排除标准
纳入标准：根据文章题目及摘要进行初步筛选，通过文献精读和泛读后设计提炼出与文章相关的研究原著、综述及论著。
排除标准：研究目的及内容与此研究无关的文献;重复性研究。
1.3数据的提取
共检索到文献189篇，英文文献158篇，中文文献31篇，排除与研究目的相关性差及内容陈旧、质量不高、重复文献133篇，纳入56篇符合标准的文献进行综述，见图1，分别探讨血管内皮生长因子及其在牙髓再生中的作用、牙髓干细胞的分泌活性，着重探讨牙髓干细胞表达分泌血管内皮生长因子的影响因素。
2结果Results
2.1血管内皮生长因子结构及其在牙髓再生中的作用血管内皮生长因子是由相对分子质量为17000-22000的同源二聚体通过二硫键连接而成的糖蛋白，其相对分子质量为34000-45000，与血小板源性生长因子有一定的同源性。人类血管内皮生长因子的基因为单一基因，长约14kb，定位于染色体的6p21.3上，由7个内含子和8个外显子交替构成。血管内皮生长因子家族主要包括血管内皮生长因子A、B、C、D及胎盘生长因子等。血管内皮生长因子A根据其氨基酸末端长度分为血管内皮生长因子206、189、165、145及121，共5种异构体。
牙髓再生是借助生物学手段，采用组织工程原理实现受损牙髓以及根尖周组织的再生与修复，使牙髓继续发挥营养、感觉、防御等功能[2]，尤其在牙髓血管生成以及神经保护与再生方面，血管内皮生长因子发挥至关重要的作用。在血管生成过程中，血管内皮生长因子促进细胞增殖、迁移及干细胞的内皮细胞向分化，减少内皮细胞凋亡，促进细胞外基质降解，增加血管通透性[3-6]。目前已有利用载血管内皮生长因子微球和牙髓干细胞在体内实现牙髓再生及血管形成的报道[7]。血管内皮生长因子还可直接刺激神经前体细胞增殖或通过刺激内皮细胞释放神经营养因子促进神经再生，并通过促进神经节轴突再生以及干细胞向许旺细胞分化，进而促进许旺细胞生长、存活而保护神经[8-12]。此外，血管内皮生长因子还可促进牙髓干细胞的成牙本质细胞向分化[13]。因此，血管内皮生长因子未来有望为牙髓血管生成、牙本质形成、神经再生等问题提供新的治疗途径。
2.2牙髓干细胞的分泌活性牙髓干细胞具有很强的细胞因子分泌活性，可分泌表皮生长因子、脑源性神经营养因子、神经生长因子以及多种与血管生成有关的生长因子。目前已发现由牙髓干细胞分泌并促进血管生成的因子包括血管内皮生长因子、血小板源性生长因子、成纤维细胞生长因子、白细胞介素8、单核细胞趋化蛋白1、基质金属蛋白酶9、胰岛素生长因子1及转化生长因子β等;抑制血管生成的因子包括内皮抑制素、胰岛素生长因子结合蛋白3等。此外，在牙髓干细胞的条件培养基中还发现了纤溶酶原激活物抑制物1、金属蛋白酶组织抑制因子1、尿激酶型纤溶酶原激活物等因子，这些因子参与细胞外基质的改建，可能与内皮细胞迁移有关。BRONCKAERS等[14]利用抗体芯片分别测定牙髓干细胞溶解物及牙髓干细胞条件培养基中55种与血管生成有关的蛋白，并用反转录-聚合酶链反应和酶联免疫吸附实验分别测定血管内皮生长因子的表达及牙髓干细胞条件培养基中血管内皮生长因子的含量。结果表明血管内皮生长因子蛋白在6个不同供体的细胞裂解物及条件培养基中均有存在;血管内皮生长因子基因在6个供体中均有表达。因此，牙髓干细胞有望成为外源性血管内皮生长因子的替代来源[1]。
2.3影响牙髓干细胞表达分泌血管内皮生长因子的因素
2.3.1缺氧缺氧被认为是刺激牙髓内血管内皮生长因子表达一个重要因素。牙齿创伤及正畸治疗中的正畸力均可导致牙齿移动，牙髓内血管压缩，形成缺氧环境。缺氧诱导因子1α是一种特异性DNA结合蛋白，与缺氧上调血管内皮生长因子基因表达密切相关。WEI等[15]对牙齿施加适当的机械负荷，牙髓内缺氧诱导因子1α和血管内皮生长因子表达呈现先增强后减弱的趋势，这可能是因为早期缺氧环境上调牙髓内缺氧诱导因子1α表达，而血管内皮生长因子的表达由于血管暂时闭塞而下降。随着时间推移，血管闭塞造成牙髓内局部缺氧，血管内皮生长因子含量逐渐升高，诱导血管不断生成，缺氧得到改善，最终使牙髓内组织达到稳态。另一项研究发现在缺氧环境中，牙髓内血管内皮生长因子的表达水平上升，而将处于缺氧条件下的牙髓细胞重新置于有氧环境后，其血管内皮生长因子表达降至原有水平，这表明缺氧促进牙髓内血管内皮生长因子表达的过程是可逆的，牙髓内血管内皮生长因子可通过改变缺氧/复氧环境进行调控[16]。上述研究尚未探讨缺氧对牙髓干细胞内血管内皮生长因子基因的调控作用及机制。ARANHA等[17]使用缺氧诱导因子1α抑制剂YC-1并不能使血管内皮生长因子表达量下降至原有水平，这可能是由于其他转录因子通过其他途径参与缺氧诱导的血管内皮生长因子表达，具体作用机制还需进一步研究。
缺氧可促进牙髓干细胞分泌血管内皮生长因子，不同研究中培养牙髓干细胞所使用的氧体积分数均不同。ARANHA等[17]和GORIN等[18]实验中使用体积分数为1%O2培养牙髓干细胞。AHMED等[19]研究表明，体积分数为5%O2条件下牙髓干细胞中血管内皮生长因子表达量显著高于体积分数为20%和3%O2条件下血管内皮生长因子表达量。鉴于实验的培养条件各异，目前仍未确定使牙髓干细胞达到最佳分泌活性的氧体积分数。
最近一些研究发现使用脯氨酰羟化酶抑制剂等缺氧模拟剂可通过缺氧诱导因子1α/血管内皮生长因子途径上调牙髓细胞内血管内皮生长因子的表达，然而这种方法对牙髓干细胞分泌血管内皮生长因子的影响及其临床应用仍需进一步研究[20-22]。
2.3.2细菌毒力因子与炎症因子细菌毒力因子主要包括脂多糖及脂磷壁酸。脂多糖是革兰阴性菌细胞壁上的特殊成分，有研究发现脂多糖可促进人牙髓干细胞的成牙本质向分化[23]，因此脂多糖可能在治疗感染牙髓及促进组织再生方面具有潜在的治疗作用。Toll样受体4是细胞识别脂多糖的重要分子，也是脂多糖信号转导途径中的关键分子，多分布在T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞及胎肝脏、肺脏、脾脏等组织中。BOTERO等[24]使用脂多糖分别处理鼠成牙本质样细胞(MDPC-23)、未分化的牙髓细胞(OD-21)、鼠巨噬细胞及牙龈纤维细胞，并评估它们表达血管内皮生长因子的情况。结果显示在MDPC-23细胞和鼠巨噬细胞中血管内皮生长因子蛋白表达上调，而在未分化的牙髓细胞及牙龈纤维细胞中的表达不明显;所有细胞处理组均未发现血管内皮生长因子在mRNA水平的改变，提示脂多糖通过转录后加工途径调节血管内皮生长因子的表达，Toll样受体4可能在这一过程中具有重要作用[25]。人牙髓成纤维细胞与牙髓干细胞均可表达Toll样受体4，有研究表明牙髓卟啉单胞菌的脂多糖通过Toll样受体4及丝裂原活化蛋白激酶信号通路诱导人牙髓成纤维细胞及牙髓干细胞表达血管内皮生长因子[26]，这种效应具有时间及剂量依赖性。施俊等[27]研究发现低质量浓度脂多糖(1，10μg/L)对牙髓干细胞增殖具有促进作用，且上调人牙髓干细胞矿化相关蛋白(碱性磷酸酶、骨钙素、骨唾液酸蛋白、牙本质涎磷蛋白)表达水平，促进牙髓干细胞的成牙本质向分化，而高质量浓度脂多糖(1000μg/L)抑制牙髓干细胞的增殖，因此利用低质量浓度脂多糖实现牙髓内血管生成及牙本质再生可能成为牙髓再生的新途径。在继发感染和再感染根管中常分离出革兰阳性菌，这些细菌可以产生大量脂磷壁酸并释放到细胞外基质中。TELLES等[28]研究发现脂磷壁酸诱导鼠牙髓中的巨噬细胞产生血管内皮生长因子蛋白的量与基础水平相比增加9倍，在鼠成牙本质样细胞中增加2.4倍，在未分化的牙髓细胞中增加了1.6倍，而对成纤维细胞无诱导效果。目前有关脂磷壁酸对人牙髓干细胞影响的研究较少，脂磷壁酸对牙髓干细胞分泌血管内皮生长因子的影响还需进一步探究。
影响牙髓干细胞分泌血管内皮生长因子的因素相关期刊推荐：《中国组织工程研究》(旬刊)创刊于1997年，是中华人民共和国卫生和计划生育委员会主管，中国康复医学会;中国组织工程研究杂志社主办的部级学术期刊。杂志的宗旨为面向国际，立足本土，力争办成传播中国组织工程领域学术研究成果和受中国组织工程研究领域专业读者认可的国际化学术期刊。主要设有：生物材料研究 、组织工程研究 、干细胞培养与移植研究 、软组织工程研究 、器官移植研究 、硬组织工程及植入物研究 、组织工程实验造模、方法及技术研究等栏目。
在急性牙髓炎早期，龋源性细菌细胞成分及其产物经由牙本质及根管侵入血管并使其扩张，炎细胞浸润、聚集，并分泌白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素8、肿瘤坏死因子α、干扰素γ等炎症因子，增加血管内皮生长因子的表达范围及强度，促进微血管形成，而血管生成带来炎细胞及免疫活性物质，引导牙髓对损伤产生防御反应;当牙髓炎发展至晚期，由于炎症高浸润区牙髓组织的修复能力下降，大量炎症因子促使血管通透性增加，血管内压升高，同时局部出现坏死灶，进一步导致微循环障碍，微血管密度减少，组织修复能力进一步下降，形成恶性循环，最终将导致不可逆性牙髓炎及牙髓坏死。然而如果炎症反应水平很低，则可能促进修复机制。因此，炎症反应在牙髓再生中是一把“双刃剑”[29-32]。LEE等[33]使用CO2激光照射牙髓组织，结果发现牙髓组织局部温度上升，在6，12，24h时肿瘤坏死因子α和白细胞介素1α水平显著上升。在激光照射后牙髓组织即刻出现轻微的退行性变，在第5天后牙髓成牙本质细胞下层可见血管内皮生长因子的表达，提示CO2激光照射引发的炎症反应可能有利于修复损伤的牙髓组织。BOYLE等[34]在含有体积分数为3%血清的条件培养基中添加肿瘤坏死因子α培养牙髓干细胞，分别记录0，4，6，12h时血管内皮生长因子的表达量，结果发现利用肿瘤坏死因子α处理可使牙髓干细胞内血管内皮生长因子表达水平上升。Boyle还发现肿瘤坏死因子α可在短时间(6h及12h)内通过激活核转录因子κB(NF-κB)通路诱导牙髓干细胞的凋亡，在长时间(14d)处理后牙髓干细胞的矿化潜力被削弱，而牙髓干细胞增殖能力提升。尽管肿瘤坏死因子α能促进牙髓再生中血管生成，对牙髓干细胞增殖也有积极影响，但其不利于牙本质再生，因此肿瘤坏死因子α对牙髓再生的最终效果还有待观察。干扰素是1957年发现的第一个细胞因子，具有抗病毒、抗细胞增殖及免疫调节等功能。STROJNY等[35]在成牙本质分化培养基中加入500U/mL干扰素γ培养牙髓干细胞，测定在0，12，24，48，72h时血管内皮生长因子的RNA含量。结果表明血管内皮生长因子的表达呈时间依赖性，在24h时血管内皮生长因子的表达有显著提升。因此，在控制炎症因子剂量的前提下，应用炎症因子可有效提高牙髓干细胞分泌血管内皮生长因子的能力。
2.3.3生长因子在组织工程中，生长因子与材料支架结合可促进干细胞增殖与分化，多种生长因子可共同作用于干细胞并调节其分泌活性。JIN等[36]使用5%的浓缩生长因子及血管内皮生长因子共同诱导牙髓干细胞来源内皮细胞形成血管样结构。与单独使用血管内皮生长因子对照组相比，实验组可见更高比例的血管形成，证实浓缩生长因子能促进牙髓干细胞介导的血管生成过程。然而不同生长因子成分对牙髓干细胞分泌血管内皮生长因子的影响仍需进一步分析。成纤维细胞生长因子2是促进细胞分泌血管内皮生长因子的诱导剂，GORIN等[18]研究表明一定质量浓度(10μg/L)的成纤维细胞生长因子能促进脱落乳牙牙髓干细胞分泌血管内皮生长因子，其效应比缺氧环境(1%O2)下诱导产生血管内皮生长因子更强，且成纤维细胞生长因子2和缺氧促进脱落乳牙牙髓干细胞分泌血管内皮生长因子具有协同效应。骨形态发生蛋白2属于转化生长因子超家族的一员，是诱导牙髓干细胞成牙本质分化的一个重要细胞因子，也可激活VEGFA/VEGFR2信号通路促进内皮细胞增殖和迁移。AKSEL等[37]将载骨形态发生蛋白2的脱矿牙本质与纤维蛋白凝胶共培养牙髓干细胞，结果显示与不含骨形态发生蛋白2的对照组相比，实验组牙髓干细胞表面血管生成因子CD31表达量上升，而骨形态发生蛋白2对牙髓干细胞分泌血管内皮生长因子的影响仍需更深一步的研究。
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