摘要：目的 了解新疆流行性感冒(流感)病毒检出的时间分布，初步分析2017—2020年季H3亚型流感HA基因的演变过程以及与疫苗株匹配情况，为科学防控流感提供依据。 方法 分析流感监测系统中2017—2020年全疆流感网络实验室的流感核酸检测结果;对每个流行年度2株季H3亚型毒株的HA基因进行测序，与每年的疫苗株一起绘制种系发生树。 结果 2017—2020年全疆流感网络实验室检测样本50 515份，流感病毒检出阳性率为14.64%，季节性流感4 种亚型均有检出，其中阳性率甲型 11.12%、乙型 3.52%，甲型流感 H3N2 亚型检出最多(38.25%)，其次是新甲 H1(37.71%);阳性率2018年最高(21.85%)、2020年最低(3.99%)，2017—2020年总体检出阳性数较高的3个月依次为 12月(2 473份，33.44%)、1月(1 995份，26.97%)和11月(1 224份，16.55%)。2017年和2018年的4个HA序列结果在一个小分支，2019年和2020年6个序列在一个小分支，10株均与疫苗株A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016在同一分支，疫苗株A/Hong Kong/4801/2014和A/Kansas/14/2017在单独的分支。 结论 2017—2020年新疆流感检出集中在11月至次年1月，甲型流感检出率高于乙型流感，2019—2020年新疆H3N2亚型流行株与2019年推荐的疫苗株不在同一分支上;流感网络实验室连续开展流感监测，有助于及早发现流感病毒的变异特征。
关键词：流行性感冒;H3N2;HA;核酸检测;测序
甲型流行性感冒(流感)病毒，因其具有广泛的宿主，自被人类发现以来，流感病毒在历史上曾造成多次大流行，如 1918 年 H1N1，1957 年 H3N2，1968 年 H3N2 及 2009 年 A(H1N1)pdm 09 的 4 次大流行[1]。由一种新型的 H1N1 病毒导致了 2009 年一场流感大流行，其中214个国家的数百万人发生感染[2]。虽乙型不易导致大规模流行，但也可引起小规模的暴发流行[3]。2003 年新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心设立流感监测室，2009年有17家哨点医院和15家网络实验室纳入监测网络[4]。本文分析了 2017—2020 年流感网络实验室核酸检测结果，了解新疆流感流行规律和甲型H3N2亚型流感病毒HA基因演变过程以及与疫苗株匹配情况，为流感的科学防控提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料 咽拭子标本来自于 2017 年 1 月 1 日— 2020年12月31日新疆流感监测哨点医院门诊监测病例，根据《全国流感监测指南(2017 年版)》[5]，采集发病3 d以内流感样病例(体温≥38 ℃，伴咳嗽或咽痛之一)咽拭子，48 h内送至对应的流感网络实验室保存在 4 ℃，否则放置-70 ℃及以下保存，避免反复冻融标本。
1.2 方法
1.2.1 流感病毒核酸检测 采用天隆半自动核酸提取仪 NP968，使用百世诺提取试剂盒，提取咽拭子标本 RNA，采用国家流感中心下发的荧光定量 PCR 引物和AgPath-IDTM One-step RT-PCR试剂盒检测流感病毒并分型，同时设立阴性和阳性对照。
1.2.2 流感病毒的分离和鉴定 咽拭子标本在试管内充分振荡混匀后接种于单层犬肾(MDCK)细胞，置于 35 ℃，5% 二氧化碳培养箱培养 3 d，待 70%～90% 的细胞发生细胞病理改变(CPE)时收获病毒培养液。以 1% 的豚鼠血红细胞悬液作血凝试验，选取滴度≥1∶8的流感毒株。
1.2.3 H3N2 亚型 HA 基因扩增和序列测定 选取 2017—2020年经病毒分离、鉴定得到的H3N2亚型流感病毒毒株，提取病毒RNA。采用Ion S5测序仪，具体操作方法参考试剂盒说明书和仪器操作说明，测序引物来于国家流感中心。选取了WHO推荐的流感疫苗株序列，2017—2020年各流感年度北半球国际疫苗株 。 以 2017—2018 年 A/Hong Kong/4801/2014[6] ， 2018—2019 年 A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016[7]， 2019—2020年A/Kansas/14/2017毒株HA基因作为基准序列[8]，序列均来自NCBI GenBank。
1.2.4 统计学分析 序列拼接由 fluABC 插件完成，采用Mega 6.06软件的Neighbor-joining法(1000 Boot‐ strap replicates，p-distance)构建系统进化树并分析其变异情况。使用R语言分析数据，采用卡方检验比较率的差异，设检验水准α=0.05。
2 结 果
2.1 流感型别检出情况 2017—2020年全疆17家哨点医院和15家网络实验室共采集检测样本50 515份、阳性率为 14.64%(7 396/50 515)，其中甲型流感病毒 11.12%(5 618/50 515)、乙型流感病毒 3.52%(1 778/ 50 515) 。 阳 性 率 2018 年 最 高 (21.85%， 2 879/13 176)、2020 年最低(3.99%、474/11 886)。阳性率 2017 年(χ2 =815.695)，2018 年(χ2 =1 718.915)， 2019年(χ2 =1 097.252)与2020年检出差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。
2.2 核酸阳性标本检出时间分布 2017—2020年总体检出阳性数较高的 3 个月依次为 12 月(2 473 份， 33.44%)、1 月(1 995 份，26.97%)、11 月(1 224 份， 16.55%)。2017 年 1—12 月均有阳性检出，检出阳性比例最高的为12月(40.04%)、其次为1月(21.09%); 2018 年 6—9 月无流感阳性样本检出，检出阳性比例最高为1月(30.67%)、其次为12月(30.32%);2019年 9 月无流感阳性样本检出，检出阳性比例最高为 12 月(39.17%)、其次为11月(15.52%);2020年6—12月无 流 感 阳 性 样 本 检 出 ，检 出 阳 性 比 例 最 高 为 1 月(91.98%)，见表2。
2.3 季节性流感4种亚型构成 2017—2020年每年4 种亚型均有检出，检出最多的亚型为甲型流感H3N2亚 型(38.25%)，其 次 是 新 甲 H1(37.71%)。 2017 年(55.17%)、2019 年(56.26%)和 2020 年(61.39%)占比最多的均为甲型H3N2亚型，2018年占比最多的为新 甲 H1(73.91%)。 2017 年(32.48%)和 2018 年(15.63%)乙型流感中占比最多的为Yamagata，2019 年(21.11%)和 2020 年(32.07%)占比最多的为 Victo‐ ria，见表3。
2.4 季H3亚型流感病毒HA片段种系进化 2017— 2020 年疫苗株分别为，2017—2018 年 A/Hong Kong/ 4801/2014，2018—2019 年 A/Singapore/INFIMH-16- 0019/2016，2019—2020 年 A/Kansas/14/2017，10 株 H3N2 亚型流感病毒 HA 基因测序结果显示，2017 年和2018年的4个HA序列结果在一个小分支，2019年和2020年6个序列均在一个小分支，属于3C.2a1b分支 ， 10 株 均 与 A/Singapore/INFIMH-16-0019/ 2016(Clade 3C.2a1)在同一分支，A/Hong Kong/4801/ 2014(Clade 3C.2a)和A/Kansas/14/2017(Clade 3C.3a)在单独的分支，见图1。
3 讨 论
2017—2019年新疆流感检出集中在11月至次年 1月，甲型流感检出率高于乙型流感，每年流感的优势亚型有所不同，与2009—2016年新疆流感流行的特点一致[4]。流感病毒经呼吸道传播，2020年10—12月未检出流感病毒，与戴口罩、少聚集等新型冠状病毒肺炎防控的非药物干预措施有关，这些措施也是流感防控的常规手段。总体上H3N2亚型占比较高，在2017 年、2019年和2020年占比最多，但2018年新甲H1亚型占比较多，2017—2018年乙型流感病毒中Yamagata 亚型占比较多，2019—2020 年 Victoria 占比较多。在自然条件下，流感病毒易发生抗原变异，可导致大范围的人类流感感染。主要是因为流感病毒的基因组是分节段的，其包膜上的主要蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的核苷酸序列发生改变，且流感病毒 RNA在复制过程中不具有校正功能，发生突变的频率高于其他病毒，是流感发生抗原性变异的分子基础[9]。
相关期刊推荐：《疾病预防控制通报》创刊于1986年，由新疆疾病预防控制中心主办。是中华预防医学会系列杂志优秀期刊，1992年被评为全国基础医学寄生虫学核心期刊。主要报道鼠疫、布鲁氏菌病、克山病、大骨节病、碘缺乏病、氟(砷)中毒病、包虫病、黑热病、血吸虫病、疟疾、肠道寄生虫病、性病/艾滋病、结核病、职业卫生与职业病、计划免疫、放射卫生与放射病、消毒杀虫灭鼠、医学动物与昆虫、健康教育、社区卫生、农村卫生、妇幼保健、卫生监督等疾病预防与控制研究的相关内容。
流感的症状是临床常规诊断和治疗的主要依据。但由于流感的症状和体征缺乏特异性，易与普通感冒和其他上呼吸道感染相混淆[10]。疫苗是预防流感的重要手段，为应对流感持续的抗原进化，世界卫生组织(World Health Organization，WHO)开展了对流感病毒抗原性变化持续监测的项目，定期推荐并更新候选“疫苗株”。2017—2020 年新疆监测到的 10 株 H3N2 亚型流感病毒 HA 基因均与 A/Singapore/IN‐ FIMH-16-0019/2016(Clade 3C.2a1)在同一分支，属于 2017—2018 年 推 荐 的 疫 苗 株 A/Hong Kong/4801/ 2014(Clade 3C.2a)的子分支，但与2019—2020年推荐的疫苗株A/Kansas/14/2017(Clade 3C.3a)不在同一分支上。2019年和2020年6个序列属于3C.2a1b分支， A/Kansas/14/2017(Clade 3C.3a)细胞株免疫的雪貂血清能抑制3C.3a分支的毒株，鸡胚株免疫的雪貂血清抑制结果稍差一些，但均不能很好地抑制3C.2a1b分支的毒株[8]，疫苗中的H3N2亚型组分存在脱靶显现。造成推荐疫苗株滞后的原因比较多，C A Russell等认为在东亚和东南亚地区由于流感流行季节在时间上的重叠，使得病毒可以在该地区常年持续流行，导致产生新抗原株并不断向全球各地传播[11]。但WHO需要病毒在整个北半球均流行时才更换疫苗，可能与当时的监测密度不够、未及时分离到新的抗原类病毒有关[12]。2020—2021 年北半球流感疫苗 H1N1 推荐组分 A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019 (H1N1) pdm09 由我国广东茂名市分离并上交国家流感中心确认后提交WHO[13]，WHO推荐的疫苗株可能滞后于实际在中国流行的病毒。
流感病毒抗原快速变化，产生新的抗原类，可能导致了病毒在某些年的基因整体选择压力和各个抗原类的流行强度不是完全匹配，然后必须更新流感病毒疫苗株。流感确诊有赖于实验室诊断，检测方法包括病毒核酸检测、病毒分离培养、抗原检测和血清学检测[14]。通过流感网络实验室对流感病毒的实时检测，并及时开展样本病毒分离及测序工作，可以及时掌握流感亚型流行的情况，为流感疫苗株的推荐提供数据，为流感防控提供科学依据。——论文作者：赵俊，陈媛，张璇，丽娜·吐尔逊巴依，刘红斌，马合木提
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