摘要：目的构建稳定过表达XAF1基因A2780卵巢癌细胞株，并观察XAF1基因对卵巢癌细胞增殖、凋亡、细胞周期及对紫杉醇敏感性的影响。方法分别将质粒pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)-XAF1转染至卵巢癌细胞A2780，通过质粒抗性标记(遗传霉素G418)筛选得到阴性对照细胞株(A2780/Negativecontrol,A2780/NC)和稳定表达XAF1的细胞株(A2780/XAF1);通过行细胞克隆形成实验和CCK8实验检测细胞增殖及对紫杉醇的敏感性，流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡。结果成功构建了稳定表达XAF1的卵巢癌细胞A2780/XAF1，细胞形态无明显变化;与A2780/NC相比，A2780/XAF1克隆形成能力能力更低(P=0.0016)，细胞贴壁后第1天和第3天增殖活性更低(P=0.009，0.0035)，两组细胞的细胞周期分布差异存在统计学意义(P<0.0001)，两两比较结果显示A2780/XAF1组G2-M期细胞百分比显著增加(P<0.001)。在无凋亡刺激、无血清培养及紫杉醇诱导下，A2780/XAF1的凋亡率均比A2780/NC更高(P<0.001);在不同紫杉醇浓度作用下，A2780/XAF1的增殖活性均显著低于A2780/NC(P<0.001)，且A2780/XAF1的紫杉醇半数抑制浓度显著低于A2780/NC。结论成功构建稳定表达XAF1的卵巢癌细胞A2780/XAF1;XAF1调控卵巢癌细胞A2780的增殖、凋亡及细胞周期，并增加了卵巢癌对紫杉醇的敏感性。
关键词：卵巢癌;XAF1基因;细胞增殖;紫杉醇;细胞凋亡;细胞周期
卵巢癌具有早期诊断率低，复发率高，致死率高的特点，因其发病隐匿，约70%的卵巢癌患者诊断时已属晚期(FIGOⅢ~Ⅳ期)，目前卵巢癌的治疗方案是手术辅以铂类联合紫杉烷类药物化疗[1-3]。通常初期行化疗的患者均有较好的疗效，但在后期仍有大量患者病情会发展到终末期，耐药随之出现[4]。癌细胞对凋亡的抵抗是导致多种化疗药产生耐药的重要因素，诱导肿瘤细胞凋亡有助于增加化疗药的效果，而XAF1在这个过程中起着重要作用[5-7]。
X-连锁凋亡抑制蛋白相关因子(XAF1)是XIAP的内源性抑制因子，XIAP是一种强烈的凋亡抑制蛋白，通过与Caspase3、7、9结合，阻止终末凋亡反应[8]。XAF1在正常细胞中广泛表达，然而在恶性肿瘤中包括卵巢癌[9-10]呈低表达或者缺失表达[11-13]，主要原因是启动子的高甲基化[14-16]。XAF1低表达与恶性肿瘤细胞的过度增殖、Caspase活性增加以及多种凋亡诱导因子，恢复XAF1的表达可抑制肿瘤生长，促进凋亡发生并增加肿瘤对凋亡诱导因子的敏感性[17-18]。此外，XAF1可抑制肿瘤细胞的周期进展，包括诱导G0~G1期[9]、G1期[13]、G2-M期阻滞[19-21]，促进有丝分裂灾难的发生[19-20]。在临床组织样本中，XAF1的表达量及甲基化状态与肿瘤分化程度[10,22-24]、分期[21,23]、耐药[10,25]、生存期[21,25-26]等相关，XAF1表达越低肿瘤预后越差[14,21]。因此，XAF1在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用，有望成为肿瘤治疗的新靶点。
卵巢癌易复发并伴随化疗耐药同时出现，寻找其治疗靶点已成为新的研究热点。曾有学者检测了上皮性卵巢癌中XAF1的表达发现XAF1呈低表达，并与卵巢癌的分化程度及预后相关，稳定过表达XAF1后抑制卵巢癌细胞SKOV3增殖，通过诱导XIAP失活、caspase-3及细胞色素c激活促进凋亡发生发生进而增加SKOV3细胞对顺铂的敏感性[10]。进一步，ZHAO等通过质粒转染技术增加了卵巢癌细胞SKOV3及其顺铂耐药株SKOV3/DDP中XAF1的表达，发现XAF1有较强的抗侵袭作用，通过抑制XIAP表达、激活caspase3、9促进SKOV3和SKOV3/DDP凋亡，增加了对顺铂的敏感性，此外XAF1诱导SKOV3和SKOV3/DDP细胞G0/G1阻滞[9]。综合以上研究说明XAF1可能是抑制卵巢癌生长的重要基因，并且增加了卵巢癌对顺铂的敏感性。因研究数目少，且均只用了一种卵巢癌细胞株即SKOV3进行实验,故进一步采用不同的卵巢癌细胞株对XAF1在卵巢癌中的作用进行验证是极其必要的。除此之外，紫杉醇作为卵巢癌化疗的重要组成部分，其耐药已成为影响卵巢癌预后的主要因素之一，寻找紫杉醇增敏剂对于提高卵巢癌疗效尤其重要。与顺铂诱导细胞DNA损伤不同，紫杉醇通过抑制细胞有丝分裂，诱导细胞G2-M期阻滞进而杀死肿瘤细胞，而目前XAF1与卵巢癌紫杉醇增敏的相关研究仍未见报道。
本研究采用卵巢癌细胞A2780构建XAF1稳定过表达模型，研究XAF1基因对卵巢癌细胞的增殖、凋亡、细胞周期及紫杉醇敏感性的影响，旨在探究XAF1在卵巢癌发生发展中的作用提供新的更稳定的实验模型，并为卵巢癌患者靶向治疗提供新的靶点思路。
1材料和方法
1.1细胞及主要试剂仪器
人卵巢癌细胞株A2780(ECACCcatalogueno.93112519)来源于本实验室;pcDNA3.1(+)-XAF1重组载体及阴性对照pcDNA3.1(+)载体构建于天津赛尔技术有限公司;转染试剂LipofectamineTM2000(invitrogen);RP1640培养基(Gibco);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);TRIzol、逆转录试剂盒、2×PCRmastermix(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，主要PCR仪(Bio-Rad)型号为CFX96;CCK8试剂盒(Biosharp);流式细胞仪型号为MilliporeGuava;酶标仪型号为CMaxplus。
1.2细胞培养
人卵巢癌细胞株A2780被培养于含10%的胎牛血清、青霉素和链霉素(1∶100)的RPMI1640培养基中，置于37℃，5%CO2及90%相对湿度的细胞培养孵箱中。细胞单层贴壁生长，呈上皮细胞形态，扁平椭圆，每2~3d传代1次。
1.3A2780细胞的G418筛选最佳浓度确定
pcDNA3.1(+)载体在真核细胞中表达neo基因，即带有遗传霉素(G418)抗性，首先确定A2780细胞本身对G418的耐受程度，即确定最佳筛选浓度。取对数生长期A2780细胞接种于24孔板，细胞密度1.0×105/mL，每孔G418浓度分别为50、100、200、400、600、800、1000、1100μg/mL，培养至第6天1100μg/mL筛选的卵巢癌A2780细胞全部死亡，因此选择1100μg/mL作为最佳筛选浓度。
1.4细胞转染和稳定转染细胞的筛选
取对数生长期A2780细胞接种于6孔板，设置空白对照孔，细胞密度1.5×105/mL，当细胞融合度至70%时，换为无血清培养基，3h后，用LipofectamineTM2000转染试剂将，pcDNA3.1(+)-XAF1重组载体及阴性对照pcDNA3.1(+)分别转染进A2780细胞中，6~8h后换为含血清培养基，转染后72h传代至6孔板，在含有G4181100μg/mL培养基中连续筛选18d，细胞克隆集落形成，生长状态良好，验证XAF1的表达并保种，分别命名为A2780/XAF1和A2780/NC。
1.5RNA提取及实时荧光定量PCR验证XAF1的表达
复苏保种的A2780/XAF1和A2780/NC，在含有G418(550μg/mL)的培养基中维持培养，传代2次后，收集对数生长期的细胞，采用TRIzol法提取总RNA，按试剂盒说明书进行逆转录合成cDNA。在NCBI人类基因组数据库设计引物，人XAF1基因上下游引物序列分别为5'-GATGTCTGTCGCAGTGAA-3'和5'-TCTTGGTGCTTTCTTTGA-3'，人β-Actin内参基因上下游引物序列为5'-GCACCACACCTTCTACAATGAG-3'和5'-ACAGCCTGGATGGCTACGT-3'，将引物、cDNA及PCRmastermix分别加入PCR反应管，加入ddH2O至20μL，反应条件：95.0℃，30s预变性，热循环参数：95.0℃，10s，60.0℃，30s，40个循环，绘制融解曲线，每组重复3次，实验结果以2-ΔCt表示，以对照组值为1，计算A2780/XAF1的mRNA相对表达量[27]。
1.6克隆形成实验检测细胞增殖及群体依赖性
取对数生长期的A2780/XAF1(实验组)和A2780/NC(对照组)进行计数，每组细胞分别以每皿50、100、200细胞的梯度密度分别均匀接种于含培养基的6cm培养皿中，置于37℃，5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养1周。待培养皿中出现肉眼可见的克隆时，弃去上清，PBS浸洗2次，各加入500μL，0.1%结晶紫染液，染色3h后撤除染液，用PBS洗3遍，晾干后拍照，计数肉眼可见的克隆。
1.7CCK8实验检测A2780/XAF1和A2780/NC的增殖活性及对紫杉醇的敏感性
取对数生长期A2780/XAF1和A2780/NC，按照2×104/mL的密度接种于96孔板，每孔200μL，每组复5孔，分别于细胞贴壁后1、3d加入CCK8，每孔10μL，37℃孵育2h后，用酶标仪测量450nm处吸光值(A450nm)，细胞增殖活性用吸光值表示。
取对数生长期的A2780/XAF1和A2780/NC，按照5×104/mL的密度接种于96孔板中，100μL/孔。过夜贴壁后，取出孔板内培养液，按0，40，80，160，320ng/mL的紫杉醇浓度梯度配置培养液，加入96孔板，每组复5孔。继续培养48h后，加入CCK8，10μL/孔，37℃孵育2h。用酶标仪测吸光值A450nm，存活率(%)=A实验组/A对照组×100%，半数抑制浓度即IC50用GraphPadPrism8.3.0计算。
1.8流式细胞技术检测细胞凋亡
取对数生长期的A2780/XAF1和A2780/NC,按照1.5×105/mL的密度接种于6孔板中。过夜贴壁后，给予不同处理作用24h后，用不含EDTA的胰酶消化收集各组细胞(包括漂浮细胞)，PBS冲洗2遍，按照AnnexinVFITC/PI双染凋亡检测试剂盒(CatNO:KGA108)说明书进行染色15min后，于流式细胞仪(型号：MilliporeGuava)检测细胞凋亡率。
1.9流式细胞仪检测细胞周期
取对数生长期A2780/XAF1和A2780/NC，1.5×105/mL的密度接种于六孔板中，过夜贴壁后，消化细胞，PBS冲洗2遍，用75%乙醇固定，冻于-20℃过夜。离心后弃乙醇，PBS洗涤后，按照凋亡周期检测试剂盒说明书测量细胞周期。
1.10统计学分析
采用SPSS19.0及GraphPad8.0软件进行统计分析及作图。计量资料以均数±标准差表示，采用非配对t检验，计数资料以率表示，无序多分类行列表采用χ2检验，行Bonferroni校正卡方检验进行两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1成功构建稳定表达XAF1的卵巢癌细胞A2780/XAF1
未转染A2780空白对照组与转染质粒的细胞同步进行G418筛选，第8天，空白对照组细胞全部死亡(图1A)，第18天，A2780/NC和A2780/XAF1克隆集落形成(图1B、C)，细胞形态无明显改变。qPCR实验显示，结果以2-ΔCt表示，以对照组值为1，A2780/XAF1细胞的XAF1mRNA表达量是A2780/NC的658倍(0.075±0.04951vs0.0001±0.00009，P<0.05)。A2780/NC和A2780/XAF1均能在500μg/mLG418中维持生长，且A2780/XAF1的XAF1mRNA表达量增高，稳定表达XAF1的卵巢癌细胞A2780构建成功。
2.2XAF1抑制卵巢癌细胞A2780的增殖
经肉眼计数，A2780/NC的克隆形成率分别64%(32/50)、52%(52/100)及56%(112/200)，A2780/XAF1的克隆形成率分别为16%(8/50)、20%(40/100)及20.5%(41/200)。计算两种细胞的平均克隆形成率，进行差异性检验，发现A2780/NC与A2780/XAF1的克隆形成能力差异有统计学意义(图2A，P=0.0016)。
在细胞接种贴壁后第1、3天，A2780/XAF1的增殖活性均比A2780/NC低，差异有统计学意义(图2B)，进一步分别计算两种细胞的增殖速度，发现A2780/XAF1的增殖速度比A2780/NC低。
2.3XAF1诱导卵巢癌细胞A2780的G2-M期阻滞
我们采用流式细胞仪检测了A2780/NC和A2780/XAF1处于不同细胞周期的比例。统计学分析发现，A2780/NC和A2780/XAF1的细胞周期分布差异存在统计学意义(χ2=150.386，P<0.001)，两两比较结果显示，A2780/NC和A2780/XAF1处于G0~G1期、S期的细胞比例差异无统计学意义(χ2=3.888，P>0.05);两组细胞在G0~G1期、G2-M期的分布差异有统计学意义(χ2=135.775，P<0.001)，A2780/XAF1组G2-M期细胞百分比更高;两组细胞在S期、G2-M期的分布差异有统计学意义(χ2=66.41，P<0.001)，A2780/XAF1组G2-M期细胞百分比更高(图3)
2.4XAF1不仅单独诱发凋亡发生，且促进无血清及紫杉醇诱导的凋亡反应
在缺乏凋亡诱导因子的作用下，A2780/NC和A2780/XAF1的总凋亡率分别为3.83%、5.39%，早期凋亡率分别为1.64%、2.97%，差异均有统计学意义(P<0.001);在无血清刺激作用后，总凋亡率分别为6.36%、8.13%(P<0.001)，早期凋亡率分别为3.14%、4.82%(P<0.001);在紫杉醇80ng/mL作用下，总凋亡率分别为6.91%、12.67%(P<0.001)，早期凋亡率分别为3.75%、5.95%(P<0.001、图4)。
2.5XAF1增加了卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性。
不同紫杉醇浓度下相对于无紫杉醇作用下的卵巢癌细胞A2780相对存活率被计算，结果显示，相对于A2780/NC组，A2780/XAF1细胞存活率更低，差异有统计学意义(P<0.001，图5)。A2780/NC及A2780/XAF1在紫杉醇作用下的半数抑制浓度即IC50分别为896.1ng/mL(95%CI：530.1~2425ng/mL)和11.66ng/mL(95%CI：2.54~22.95ng/mL)。两因素方差分析结果显示，XAF1与紫杉醇联合对于抑制卵巢癌生长存在协同作用(P<0.001)。
3讨论
本研究采用脂质体转染法将真核表达载体pcDNA3.1(+)及其XAF1重组载体分别转染至A2780，通过抗性标记筛选使得A2780/NC与A2780/XAF1均能在G418中维持生长，经qPCR鉴定A2780/XAF1的XAF1mRNA显著增高，说明模型构建成功。该细胞模型易培养，基因表达稳定，实验重复性好，不仅为进一步体外研究卵巢癌中XAF1的相关信号通路提供了便利，还为研究XAF1在复杂多变的在体环境中的作用机制提供了实验工具。同时，我们进一步检测了XAF1基因对卵巢癌细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响，结果显示XAF1明显抑制了卵巢癌细胞的生长，促进其凋亡。这一结果从功能层次上说明XAF1基因在卵巢癌的发生发展中起到了抑癌基因的作用，与其他研究结果一致[15]。此外，在细胞周期方面，本研究结果显示XAF1诱导了卵巢癌细胞G2-M期阻滞。这与部分为胃腺癌细胞中的研究结果一致[17,19]。但是，另一项关于人胚肺成纤维细胞研究则发现XAF1稳定过表达则产生与p53一样的G1期阻滞效应，采用同样的研究方法表明XAF1并不影响宫颈癌细胞的周期分布，有研究分析这一差异是由两种细胞的转化程度不同所致，恶性程度更高、生存能力更强的Hela细胞基因组阻止了XAF1对细胞周期分布的影响[13]。在卵巢癌细胞中，有研究采用重组载体瞬时转染的方式提高SKOV3细胞株中XAF1的表达，发现XAF1诱导了SKOV3卵巢癌细胞G0~G1期细胞阻滞[9]。不同类型细胞基因组不同，故XAF1对其细胞周期的影响有所差异。A2780卵巢癌细胞来源于子宫内膜样卵巢腺癌患者，而SKOV3卵巢癌细胞来源于浆液性卵巢腺癌，COSMIC数据库显示两种组织型别p53突变频率分别为73%、51%[28]，p53的突变状态可能是XAF1对细胞周期分布影响结果不一致的原因。最后，我们用CCK8实验探究了XAF1联合紫杉醇对卵巢癌细胞生长的影响，结果显示XAF1提升了卵巢癌对紫杉醇的敏感性，两者之间存在协同作用，是卵巢癌化疗和靶向治疗的潜在增敏靶点。我们前期研究发现下调XIAP可诱导耐紫杉醇卵巢癌细胞凋亡，逆转紫杉醇耐药[29-30]，而XAF1是XIAP的内源性抑制因子，故本次研究再次证实了前期研究结果。
近年来，因卵巢癌化疗耐药及复发的频繁出现，其靶向治疗已经成为众多学者的研究的热点。卵巢癌凋亡调节相关靶向治疗研究包括bcl2家族蛋白和酪氨酸蛋白激酶及凋亡抑制蛋白(IAPs)，其中IAPs家族蛋白在抑制内源性和外源性凋亡通路均具有重要作用[31]，一项有关多种恶性肿瘤细胞(包括卵巢癌细胞)的研究发现XAF1蛋白一方面可与除Survivin以外的所有IAPs家族蛋白直接相互作用促进凋亡，另一方面通过激活XIAP-RING结构域的E3泛素连接酶促进Survivin的降解，表现为促进凋亡和有丝分裂灾难的双重作用[32]。本研究也存在一定局限性，如未探讨XAF1基因的上下游分子变化，未明确其抑癌作用具体机制，这也将是我们下一阶段研究工作的重点。
综上所述，XAF1基因是卵巢癌发生发展过程中的关键基因，其功能缺失影响相关上下游基因的表达，进而影响卵巢癌细胞的生物学功能。XAF1基因过表达稳定转染细胞株的建立将有利于研究XAF1基因对卵巢癌的作用机制，发现其上下游基因的一系列变化，对卵巢癌发生发展的具体分子生物学机制进行更深入的探讨，并可能为卵巢癌的分子靶向治疗提供新的作用靶点。——论文作者：刘娟1，2，刘星辰3，魏宝宝4，刘洁1，2，王悦华1，2，刘辉1，2
相关期刊推荐：《南方医科大学学报》(原第一军医大学学报)(ISSN1673-4254，CN44-1627/R)创刊于1981年，为国内外发行的高级综合性医药卫生期刊。设有：有基础研究、临床研究、技术方法、经验交流、病例报告等栏目。
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