摘要：目的 研究细胞自噬条件下双氧水对Jurkat细胞DNA损伤的影响。方法 利用EBSS平衡盐溶液诱导Jurkat细胞自噬，并经WB确定，然后用50 mM双氧水处理1 h，单细胞凝胶电泳检测，荧光显微镜观察与casp软件分析DNA拖尾情况。结果 在EBSS诱导的Jurkat细胞发生了自噬，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升高，双氧水对细胞DNA的损伤出现尾距增长，具有统计学差异(P<0.05)。结论 细胞自噬发生后，增强了双氧水对Jurkat细胞的DNA损伤作用。
关键词：细胞自噬;双氧水;DNA损伤
细胞自噬(autophagy)是机体组织和细胞稳态的必需，缺失将伴随很多疾病的发生，包括：神经退行性疾病、肿瘤、心脏病、脂肪肝、糖尿病和克罗恩病等，是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，藉此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新，细胞自噬与细胞凋亡、细胞衰老一样，是十分重要的生物学现象，参与生物的发育、生长等多种过程[1]。细胞自噬在肿瘤发生发展中关系密切，研究报道5-氮杂-2'-脱氧胞苷可诱导乳腺癌细胞自噬，其机制可能与其所诱导的DNA损伤有关[2]，DNA损伤是诱导细胞自噬的原因之一[3]。但也有报道认为，自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-AM)能加强X射线对人下咽癌细胞的致DNA损伤作用[4]，体外实验显示，药物诱导的细胞自噬，往往伴随着细胞周期的停滞和DNA的修复[5]。因此，有必要对细胞自噬与DNA损伤做进一步研究，了解细胞自噬的发生也有可能增强DNA的损伤。我们将利用饥饿诱导Jurkat细胞自噬后进行双氧水(H2O2)处理，观察细胞DNA损伤的情况。
1资料与方法
1.1一般资料 小牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司;RPMI1640培养基(含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)购于杭州吉诺生物医药技术有限公司;兔抗LC3和Anti-rabbit IgG(H+L)(DyLight 800)购于cell signaling公司、actin兔抗购于杭州华安生物公司;western blot凝胶电泳试剂购于武汉谷歌生物技术公司;PVDF膜为Millipore公司产品;Green-DNA Dye核苷酸胶体染料购于上海生工公司;低熔点琼脂糖为Amresco产品;H2O2购于国药集团化学试剂公司;EBSS平衡盐溶液为GIBCO公司产品;蛋白提取试剂盒购于碧云天生物技术公司;T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat为本实验室冻存细胞。
1.2方法
1.2.1细胞培养 细胞株Jurkat培养于含10%小牛血清的RPMI1640(100 U/ml青霉素，100 U/ml链霉素)的细胞培养剂中，置于37℃、饱和湿度和5%二氧化碳孵箱中培养，待生长呈对数期时备用。
1.2.2饥饿处理 Jurkat细胞收集于离心管中，200g离心5 min去上清，然后混悬于EBSS液中，再同样离心去上清，最后加入EBSS，调节细胞浓度为1×106/ml，放置孵箱中3 h后回收细胞。阴性组为正常培养细胞。
1.2.3蛋白样品制备与western blot分析 按照蛋白提取试剂盒，根据细胞数量加入相应的提取试剂，依次制备蛋白电泳样品，然后上样到12%分离胶的垂直电泳变性胶上，经电泳、转膜、封闭后，根据marker位置裁剪actin膜和LC3膜，分别进入相应抗体4℃摇床过夜，然后TBST洗涤后，一同进入Anti-rabbit IgG(H+L)(DyLight 800)反应液中作用2 h，最后洗涤用Odyssey双红外荧光扫描仪观察结果，并进行条带综合强度(Integrated Intensity)分析。
1.2.4细胞H2O2处理 上述EBSS处理3 h后的细胞，取少量冲入细胞计数板计数，按照1×106/ml接种塑料细胞培养瓶，处理组加入H2O2至50 mM，继续于孵箱中培养1 h，另两组为非EBSS处理细胞的H2O2处理与未处理组。
1.2.5细胞凝胶火箭电泳 参照文献[6]报道稍做修改，收集细胞于离心管中，离心去上清，用PBS清洗细胞，调节细胞浓度至1×105/ml，取该细胞悬液加入到10倍体积的融化后37℃保存的0.5%PBS配制的低熔点琼脂糖中，混匀涂抹到预先蜡笔划线的玻璃片上，然后转移到4℃冰箱中，15 min后取出，侵入预冷的新鲜制备的裂解缓冲液中(2.5 mol/L NaCl，100mmol/L Na2EDTA，10 mmol/L Tris，1%肌氨酸钠，1%Triton X-100调整pH至10)，45 min后，用预冷的双蒸水浸泡10 min，共3次。最后玻片放置在水平电泳槽中，加入电泳液(1 mmol/L N EDTA，300 mmol/L NaOH)，液面淹没玻片，避光静置30 min，以20V电泳30 min。取出玻片置于双蒸水中洗涤3次，5 min/次。待凝胶周围干燥后，用蜡笔画线，再用pH 7.4 TE缓冲液以1：10000稀释Green-DNA Dye染色液覆盖凝胶，15 min后去液体。用荧光显微镜观察摄像。
1.2.6图像与统计分析 网上彗星分析软件免费下载CASP，对采集到的图像进行分析，用尾距作为DNA损伤指标，并用SPSS软件进行统计学分析。
2结果
经Western blot分析发现，EBSS处理组与对照组均出现了16KD和14KD两条带，但EBSS组里14KD的量要比16KD的高，在图中体现亮度更强(图1)，而对照组中14KD含量虽然也强于16KD，但差异没有EBSS组大，两组相对actin含量，EBSS组的16KD远少于Control组，而14KD则相反，经条带综合强度(Integrated Intensity)分析，14KD/16KD值(即LC3-Ⅱ/Ⅰ)Control组为2.01，EBSS组为3.06。然后经过H2O2处理，单细胞凝胶电泳分析，DNA损伤中空白对照组A拖尾很少，H2O2处理组B拖尾增加，而EBSS作用后的H2O2处理组C拖尾最长(图2)，经CASP软件分析采集50个独立完整的DNA图像数据，并对可疑数据进行取舍，最后两两比较发现，A组尾距为0.51±0.32，B组为7.49±5.19，C组为18.01±7.89，经统计学分析，两两之间均有明显差异(P<0.05)(图3)。
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