摘 要：目的 研究制备了一种用于脱除小柴胡汤复方制剂(小柴胡颗粒剂及小柴胡水煎剂)中重金属的高效环保复合仿生材料。方法 使用SEM、TEM、FT-IR及XRD技术对仿生材料的形貌进行表征，再结合 ICP-MS与HPLC技术验证该仿生材料对不同类型重金属的脱除效率、对药效成分的影响程度等。结果 该仿生材料在水煎剂及颗粒剂中重金属 Cd，Hg，Pb 的脱除率分别为：98.66%，98.37%，99.87% 与 99.87%， 98.41%，99.92%，且药效成分黄芩苷含量减少仅为4.80%与7.38%。结论 该复合仿生材料可用于脱除小柴胡汤复方制剂中的重金属镉、铅和汞，且有效成分的损失率较低，为脱除水煎剂和颗粒剂中的重金属提供一定的理论和技术支持，并为安全使用中药材制剂提供了便捷且可靠的方法。
关键词：小柴胡汤复方制剂 重金属脱除 仿生材料 药效成分影响 指纹图谱
2017 年，我国中药材贸易稳定发展，全年中药材进出口总量 31.45万吨，同比增长 11%，进出口总额高达14亿美元[1] 。但中药材在种植、采收、加工以及储存过程中易遭受不同程度不同类型的重金属污染，导致中药材质量及安全问题频发[2-3] 。因重金属难以被生物降解，且在人体内和蛋白质及酶等发生强烈的相互作用，使酶失活，在人体器官中累积，造成慢性中毒，进而导致中药材临床使用安全性的降低。目前，我国已发布多项管理规范，例如：国家标准委员会对中药材种植环境以及包装材料做出明确限量，中国中药协会中药标准化技术委员会对中药材采收与产地初加工技术实施管理规范。此外，在《中国药典》(2015版，四部)中规定了必须进行重金属检测的中药材有：山楂、丹参、甘草、白芍、西瓜霜、西洋参、金银花、枸杞子、黄芪、石膏、煅石膏、白矾、玄明粉、芒硝、冰片、滑石粉、蜂胶、龟甲胶、阿胶、地龙、鹿角胶、水蛭、牡蛎、海螵蛸、海藻、昆布、珍珠及蛤壳。其中，明确限定了中药材中重金属的类型及最大残留限量值，包括 Pb (5 mg·kg-1 )、Cd(0.3 mg·kg-1 )、As(2 mg·kg-1 )、Hg (0.2 mg·kg-1 )及 Cu(20 mg·g-1 )，同时给出了 4 个重金属的检测方法，分别为通则 0821(重金属检测法)、通则 2321(铅、镉、砷、汞、铜测定法)、通则 2322(汞和砷元素形态及其价态测定法)及通则 9304(中药中铝、铬、铁、钡元素测定指导原则)[4] 。但是，中药材中重金属污染现象依然存在。因此，为保证人民用药安全，中药材在临床使用之前选择合理的脱除技术以及脱除材料的研发显得尤为重要。
重金属的脱除技术通常可根据重金属与无机酸、有机酸、螯合剂、微生物以及一些无机化合物的结合状态可分为：物理脱毒技术、化学脱毒技术及生物脱 除 技 术[5-10] 。 目 前 ，羟 基 磷 灰 石(Ca10(PO4)6(OH)2， Hydroxyapatite，HAP)可用于简单基质中重金属的脱除，但该材料价格较贵且重复使用率较低[11-13] 。伴随现代关键技术的突破，仿生材料的研究在食品领域取得了重大发展，目前正逐步形成新的科研领域，其材料成分壳聚糖等属于无毒的天然高分子化合物[6] ，且已有文献报道仿生材料用于中药中重金属的脱除研究[14-20] ，本文基于既往研究中构建的仿生材料模型[17] ，优化该材料的使用条件，并首次将其应用于小柴胡复方制剂中重金属Cd、Pb及Hg的脱除，详细对比仿生材料使用前后小柴胡复方制剂中重金属的脱除效率，较为全面的解析了药效指标成分黄芩苷的损失率以及小柴胡制剂指纹图谱的差异性。最终，为脱除中药材复杂基质中重金属及有害元素的其他类型材料选择，以及评价脱除重金属材料性能的主要方法提供了一定的参考价值。
1 材料
电感耦合等离子体质谱仪(Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry, ICP-MS，iCAP Q，赛默飞世尔科技公司)，扫描电子显微镜(Scanning Electronic Microscopy，SEM，德国蔡司公司);透射电子显微镜 JEM-1400 型(Transmission Electron Microscope，TEM，日本电子株式会社);傅里叶变换红外光谱仪(Fourier Transform Infrared Spectrometer，FT-IR，Tensor 27 型，布 鲁 克 光 谱 仪 器 公 司);X- 射 线 衍 射 仪(X-ray diffraction，XRD，日本岛津公司);高效液相色谱仪(High Performance Liquid Chromatography，HPLC， Prominence LC-20AT，日本岛津公司);C18 色谱柱 (Waters，150 mm × 4.6 mm.5 µm，美国安捷伦公司)。 1/10万电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司);超纯水仪(Milli-Q A10，默克化工技术有限公司);微波消解系统(CEM Mars 6，美国培安公司);恒温振荡器(培英实验设备公司);79-1 磁力加热搅拌器(科析仪器有限公司)。
Au，Cd标准溶液(1000 mg·L-1 ，有效期：2019.06.05， 2022.09.27)、Pb，Hg 标准溶液(100 mg·L-1 ，有效期：2022.07.05，2022.01.16)、黄芪成分分析标准物质(中国计量科学研究院，GBW10028，有效期：2020.01.01);黄芩苷 (成都克洛玛生物科技有限公司，纯度 ≥ 98%，批 号 CHB-H-093);纳 米 羟 基 磷 灰 石(HAP)(CAS: 1306-06-5，有效期：2021.05)、壳聚糖(CAS:9012-76- 4)、氢氧化钙(CAS:1305-62-0)(麦克林生化科技有限公司)聚天冬氨酸(美国 Sigma 公司);浓硝酸、双氧水(美国费希尔公司，分析纯);;戊二醛(西陇科学股份有限公司，分析纯);甲醇(色谱纯)、无水乙醇、醋酸、磷酸、盐酸(北京化工厂，分析纯)。
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用于制备小柴胡汤水煎液与颗粒剂的7味中药饮片购于北京同仁堂，根据《伤寒论》小柴胡汤中药材配比制备小柴胡汤剂。单批次样本精确称量24.0 g柴胡(山西)，9.0 g黄芩(山西)，9.0 g人参(吉林)，9.0 g甘草(甘肃)，9.0 g半夏(山东)，9.0 g生姜(山东)及15.9 g大枣(山东)。根据《中国药典》(2015 年版)推荐方法制备了小柴胡颗粒剂[4] ，上述实验重复多次进行后续研究。
2 方法
2.1 仪器工作参数
2.1.1 ICP-MS
等离子体功率 1550 W，辅助气体流量 0.80 L· min−1 ，载气流量 1.10 L·min−1 ，冷却气体流量 13.98 L· min−1 ，采样深度 5.0 mm，采样时间 40 s，雾化室温度为 2 化;蠕动泵转速 0.20 r·s -1 ，He 气流量 5 mL·min−1 ，采样锥孔径 1.0 mm，截取锥孔径为 0.4 mm，重复 3 次，描秒次数为100 次，分析模式为碰撞气(KED)模式，雾化室温度 2.63℃。ICP-MS所用辅助气、冷却气和载气均为高纯氩气。
(1)准确性
使用黄芪标准物质验证所建方法的准确性，结果如表 1 所示：基于该测试体系所得标准物质中重金属的测定结果均在规定范围之内。
(2)线性和检出限
取空白对照溶液连续进样11次，以空白对照溶液测定值的3倍标准偏差所对应的待测元素浓度作为检测限，将系列标准溶液分别进行分析，得到各元素的线性方程和相关系数。3 种重金属元素线性关系良好，符合分析要求(表2)。
(3)精密度
取标准品溶液重复进样6次，结果显示Cd，Hg，Pb 浓度测定值的RSD(%)分别为2.99，3.77，0.19，显示结果精密度良好。
(4)重复性试验
平行制备样品溶液9份，测定结果显示Cd，Hg，Pb 浓度测定值的RSD(%)分别为2.97、3.69、0.77，表明方法的重复性良好。
(5)稳定性试验
取样品溶液于制备后 0，3，6，9，12，24 h 进样，测定结果显示 Cd，Hg，Pb 浓度测定值的 RSD(%)分别为 3.00、3.39、0.42，表明供试品溶液在 24 h 内稳定性良好。
(6)加标回收率
分别以黄芪标准物质中 Cd、Hg、Pb 的浓度值 0.046、0.012、1.468 mg·kg-1 为基准，按照 80%、100% 和 120%，精密加入 Cd2+ 、Hg2+ 、Pb2+ 标准溶液，平行测定 3 次 ，计 算 Cd2+ 、Hg2+ 、Pb2 的 加 标 回 收 率 为 83.22- 118.31%，RSD ≤ 3.12 %，该方法的回收率良好。
2.1.2 HPLC
色谱柱：Waters C18(150 mm × 4.6 mm.5 µm);流动相：甲醇-水-磷酸(47: 53: 0.2);洗脱梯度：0-20 min，等度洗脱;流速为 1.2 mL·min-1 ;检测波长为 280 nm;柱温为 25℃;进样量为 10 uL。在上述色谱柱条件下，理论板数以黄芩苷峰计不少于 3000，分离度 > 1.5，所有组分均在25 min内出峰，各成分基线分离良好。
2.2 溶液制备
2.2.1 ICP-MS标准液及待测液的制备
精密吸取各标准储备溶液，用5%硝酸稀释，配制成以下相应元素质量浓度的混合系列溶液，Cd：0.01， 0.1，1.0，5.0，10.0，50.0，100.0，500.0 µg·L-1 ;Pb: 0.02， 0.2，2.0，10.0，20.0，100.0，200.0，1000.0 µg·L-1 ;Hg: 0.01，0.05，0.1，0.5，1.0，5.0，10.0 µg·L-1 。另精密吸取铋(Bi)、铟(In)、锗(Ge)内标溶液适量，用超纯水稀释成质量浓度为 10 µg·L-1 的混合溶液，即得内标溶液。精密量取小柴胡汤溶液 1 mL，置聚四氟乙烯消解罐中，加入浓硝酸 8.565 mL，双氧水 1.435 mL，浸泡过夜后消解[21] 。取等量浓硝酸和双氧水，采用同样方式消解，制成空白对照溶液。消解完全后，消解液冷却至 60℃以下，取出消解罐，冷却待用。将所制备的消解液转入 50 mL 容量瓶中，用少量去离子水洗涤消解罐 3 次，洗液合并于量瓶中，加入金单元素标准溶液(1 µg· mL-1 )200.00 µL，用水稀释至刻度，摇匀，即得。
2.2.2 HPLC小柴胡制剂提取液
(1)对照品溶液的制备
精密称取黄芩苷对照品 5.0 mg，置于 10 mL 容量瓶中，甲醇溶解并定容，移液枪量取 3 mL 置于 10 mL 容量瓶中，甲醇定容，制成质量浓度为 150 µg·mL-1 的对照品溶液。(2)供试品溶液的制备移液枪精密量取小柴胡水煎液(含配方饮片粉末 84.9 g)10.27 mL于圆底烧瓶中，加70 %乙醇40 mL，加热回流 3 h，冷却，过滤。待旋蒸液浓缩后将滤液置于 50 mL 容量瓶中，用少量 70% 乙醇分次洗涤容器和残渣，洗液合并定容。量取上述溶液 1 mL，用甲醇定容至10 mL容量瓶中即得小柴胡水煎液提取液。另按比例精密称取60 g小柴胡颗粒(含配方药材粉末27.16 g)超纯水溶解至68.69 mL，量取小柴胡颗粒溶液 30 mL，置于圆底烧瓶中，加70%乙醇40 mL，加热回流3 h，放冷，过滤，旋蒸浓缩后将滤液置于 50 mL 容量瓶中，用少量70%乙醇分次洗涤容器和残渣，洗液合并，定容。量取上述溶液 1 mL，用甲醇定容至 10 mL 容量瓶中，即得小柴胡颗粒剂溶液提取液。
2.3 复合仿生脱除材料的制备及使用
称取壳聚糖 0.1 g 于 50 mL 烧杯中，量取 2 mL 1% 的乙酸溶液一次性缓慢加入到烧杯中，搅拌使其成流动液体状态。缓慢加入 5 mL 6% 的磷酸，搅拌使壳聚糖全部溶解，再加入 0.1 g 聚天冬氨酸和 0.2 mL 戊二醛。将壳聚糖和聚天冬氨酸的混合液慢慢滴入含有 25 mL 1∶1 乙醇水溶液的 50 mL 烧杯中，同时滴加适量的饱和 CaCl2溶液，使用稀盐酸和 NaHCO3饱和溶液控制体系 pH = 7。滴加完毕后，继续搅拌 3-5 h，使反应完全(絮状沉淀完全，上层清液透明)。静置陈化 24 h，超纯水洗涤 3 遍，离心，烘干，研磨成粉末状待用，上述实验平行制备多次。
将 Pb，Cd，Hg 标准溶液分别加入 10 mL 小柴胡汤剂与小柴胡颗粒剂(10 g 溶于 10 mL 水溶液)中，得到含有 5.0 mg·kg−1 Pb，0.3 mg·kg−1 Cd，0.2 mg·kg−1 Hg 的小柴胡汤剂溶液及颗粒剂溶液。分别精密称取0.02 g HAP 和本研究所得复合仿生材料，置于 10 mL 上述小柴胡汤样品中，150 r·min−1 震摇 2 h，pH = 6-7，温度 18℃，测试平行样品3次。
3 结果与分析
3.1 仿生材料SEM形貌表征
脱除材料的颗粒度大小以及比表面积直接关系到脱除重金属的效率，因此脱除材料的形貌表征具有重要参考价值。由图 1 可见，制备所得仿生材料的颗粒度大小不一致，这主要是仿生材料在制备过程中在有机相溶液中不断加入无机相 CaCl2，晶体材料以 CaCl2为晶核逐渐长大形成，该过程中 CaCl2的颗粒度大小、温度和搅拌速度等都直接影响了脱除材料的尺寸。相比于仿生材料，如图 1b 所示 HAP 材料分散均匀，颗粒度小，可为高效吸附重金属提供较大的比表面积。然而 HAP 机械强度高，易碎，难以在临床医药领域得到广泛的应用[18] 。相比 HAP，仿生材料则具有较好的韧性和弹性，提高了该材料的使用次数。
3.2 仿生材料TEM形貌表征
仿生材料总体形态为颗粒度较大的物质，大小在 50 nm - 200 nm之间，HAP总体形态呈分散棒状结构，大小为20 nm - 100 nm(图2)。材料在使用前，HAP相比仿生材料具有较高的比表面积，然而 2 种材料在分别脱除重金属Cd，Hg，Pb后，仿生材料呈团聚状，但不紧密，可重复使用，HAP 材料团聚程度较仿生材料更加明显，重复使用率较低(图3)。
3.3 仿生材料FT-IR，XRD表征
仿生材料用于小柴胡汤剂中重金属脱除后， 3443 cm-1 处的 O-H 键伸缩振动峰减小，1043 cm-1 、 1013 cm-1 、923 cm-1 、620 cm-1 为 PO4 3- 振 动 峰 减 小 ， 1579 cm-1 处的峰及 1411 cm-1 和 1384 cm-1 是 C=O 的特征吸收峰增大。但主要官能团均存在，不影响后续重复使用。相比仿生复合无机材料，由 HAP材料的红外图谱可以发现，HAP 使用前后在 3570、3467 cm-1 处的 O-H的伸缩振动峰，565、640、1034 cm-1 的PO3 - 4 的特征峰未发生变化，而其在 1421 cm-1 处的 CO2 - 3 的吸收峰与 1638 cm-1 处的水吸收峰强度明显增加(图 5)。因此，无机材料HAP在使用前后对中药中药效成分有明显的吸附作用，造成了中药药效成分的损失，不适用于脱除中药基质中的重金属。
为进一步验证仿生材料在中药基质中的结合关系及使用率，对比了两种材料使用前后的结构变化。图 6 中 HAP 的结晶峰 2θ = 25.9°，31.7°，33.1°，35.6°和40°为 HAP 结构的特征峰，HAP 脱除重金属处理后的 XRD图谱中峰位置没有明显变化，但是特征峰形更加突出。仿生材料的结晶峰 2θ = 11.7°，21°，29.3°， 30.6°，34.4°，37°，41.6°，42.1°无明显变化，可见仿生材料的结构无明显改变，重复利用率高且可再生。
3.4 仿生材料与 HAP应用于小柴胡复方制剂中重金属的脱除
由于不同种药材在其种植地域及运输包装过程中所受到的重金属污染程度不同，本文以中国药典规定的重金属含量限定标准为主[22] ，对所制备的小柴胡汤制剂进行重金属加标，使其重金属Cd、Hg及Pb制剂中的含量分别达到 0.3 mg·kg-1 ，0.2 mg·kg-1 及 5 mg·kg-1 。将 HAP 与制备所得仿生材料用于小柴胡制剂中重金属 Cd、Hg及 Pb的脱除，同时使用 ICP-MS 法验证上述两种材料的重金属脱除效果(表3)。HAP在水煎剂及颗粒剂中重金属Cd，Hg，Pb的脱除率分别为：97.35%， 97.96%，98.81% 与 98.81%，98.31%，98.95%，仿生材料在水煎剂及颗粒剂中重金属Cd，Hg，Pb的脱除率分别为 ：98.66%，98.37%，99.87% 与 99.87%，98.41%， 99.92%。可见，HAP对最大残留限量浓度下的小柴胡汤剂及颗粒剂均具有一定的脱除效果，在小柴胡颗粒剂中重金属的脱除效果优于小柴胡汤剂，而仿生材料对小柴胡汤剂与颗粒剂中重金属吸附无明显差异性。因此，合成所得仿生材料对不同类型的小柴胡复方制剂中重金属的脱除效果优于市售纳米级别的HAP，并且可以将浓度超标的小柴胡制剂中重金属Cd，Hg，Pb 脱除到安全限量标准以下，有效规避了中药中重金属引起的安全性困扰。
3.5 仿生材料对小柴胡制剂药效成分的影响
3.5.1 HPLC指标药效成分黄芩苷含量分析
小柴胡复方制剂中的主要药效成分之一是黄芩苷，且《中国药典》(2015 版，一部)规定小柴胡汤中的指标性成分即为黄芩苷。因此，通过对比黄芩苷的标准溶液、小柴胡汤剂提取液和小柴胡颗粒剂在使用仿生脱除材料前后的差异性判断药效成分的干扰作用。如图7a所示，黄芩苷标准物质的保留时间为8.877 min，对比图 7b 和图 7c 可以发现，该仿生脱除材料吸附了小柴胡汤剂中4.8%的黄芩苷，同时吸附了小柴胡颗粒剂中7.4%的黄芩苷(图7d和7e)。这主要是由于黄芩苷中的羟基、羧基、羰基与仿生材料中的羟基、羧基与羰基发生羟醛缩合及酯化反应导致的。综上，该仿生材料对小柴胡制剂中的药效指标性成分黄芩苷的吸附作用较小。
3.5.2 小柴胡汤指纹图谱相似度分析
虽然黄芩苷为小柴胡复方制剂中的药效成分，但制剂中的其他化学成分也有一定的药效价值，因此，通过指纹图谱的研究，可以明确仿生材料对其他化学成分的影响。取小柴胡汤剂与小柴胡颗粒剂及其经仿生材料脱除重金属后的溶液，按照2.2.2项下的的方法制备供试品溶液，按 2.1.2 项的色谱条件检测，记录色谱图。将所有数据导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本)”软件进行处理。选取 R作为对照指纹图谱，选择中位数法生成对照图谱，时间窗宽度设为 0.2，运用自动峰匹配进行全谱峰匹配，并生成对照指纹图谱(图8)，小柴胡制剂指纹图谱自动匹配共得到18个共有峰。
基于国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723 版本)”软件对仿生材料脱除重金属前后的小柴胡汤剂及小柴胡颗粒剂进行相似度评价，结果见表5。
S1-S3 间差异 0.968 与 S2-S4 间差异 0.960 说明本研究自制的小柴胡复方制剂之间的质量相似度较高，均在 0.960 以上，可见制备所得小柴胡汤剂与小柴胡颗粒剂的质量比较接近，但可能由于制备过程中受到温度、搅拌速度等因素的影响而表现出一定的差异，然而完全符合小柴胡复方制剂的要求。此外，使用仿生材料脱除小柴胡汤剂和颗粒剂溶液中的Cd，Hg，Pb 前后，其相似度分别为0.999及0.996，表明该仿生材料对小柴胡复方制剂中的化学成分影响较小，主要化学成分未发生明显变化。
4 结语
本研究合成并考察了一种用于脱除小柴胡汤复方制剂(小柴胡颗粒剂及小柴胡水煎剂)中重金属Cd、 Pb 及 Hg 的高效环保复合仿生材料，结合 SEM 技术考察了仿生材料与市售纳米级别HAP材料的微观形貌，并通过ICP-MS技术对比了该仿生材料与HAP材料在水煎剂及颗粒剂中重金属Cd，Hg，Pb的脱除率。相比于HAP，仿生材料在脱除小柴胡汤剂及颗粒剂中重金属 时 表 现 出 更 佳 的 脱 除 效 果 ，其 脱 除 率 分 别 为 ： 98.66%，98.37%，99.87% 与 99.87%，98.41%，99.92%。基于小柴胡复方制剂中指标性药效成分黄芩苷的含量变化，得出该仿生材料可吸附少量的黄芩苷，但其在汤剂及颗粒剂中含量的减少仅为 4.80% 与 7.38%。同时，结合小柴胡复方制剂的指纹图谱中 99.6% 以上的相似度可以得出：该仿生材料对小柴胡颗粒剂及小柴胡汤剂中的药效成分的影响较低。
综上所述，该复合仿生脱除材料可用于小柴胡汤复方制剂中的重金属Cd、Pb及Hg的脱除，为安全使用中药材制剂提供了便捷且可靠的方法。相较于市售材料，复合仿生脱除材料价格低廉、绿色环保且重金属脱除效率完全满足国家药典的要求，进一步降低了中药材中重金属对人体的可能危害。此外，该实验体系针对适用于脱除中药材中重金属的材料的深入研究给出了较为详细的评价方法，对其他类型中药材中有害污染物的脱除材料的评价提供了参考价值。近年来，我国对中药材的污染防治主要体现在种植环境、加工炮制、储藏运输方面。但是，在重金属快速高效脱除方面发展缓慢，且复合仿生脱除材料仍然存在着以下问题：仿生材料的使用寿命、稳定性及非特异性结合能力依旧有待提高;仿生材料使用条件及适用范围仍需优化及深入开发;尚未实现多种重金属及有害元素的同步脱除。因此，随着对复合仿生脱除材料的进一步研究，未来有望开发出一系列可用于同步脱除多类型及多价态重金属的高效环保脱除材料。——论文作者：孔丹丹1 ，王 蓉1，2 ，郭一飞1 ，李歆悦1，2 ，杨世海2 ，杨美华1**
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