摘要:为了解秦皇岛地区犊牛沙门氏杆菌的流行情况、致病性和耐药性，试验对2019年从秦皇岛肉牛场采集的51份肛拭子样品进行细菌的分离鉴定、血清型鉴定、小鼠致病性试验、毒力基因检测和药物敏感性试验。结果表明:共分离出11株沙门氏杆菌，分离率为21.57%(11/51)，其中6株为甲型副伤寒沙门氏杆菌，3株为病牛沙门氏杆菌，2株为肠炎沙门氏杆菌。11株沙门氏杆菌分别感染小鼠后小鼠死亡率为20%～100%。11株沙门氏杆菌分别携带3～11种毒力基因，其中spvA、spvR、stN基因检出率最高，为63.64%(7/11)，未检出spvB、mgtC基因。11株沙门氏杆菌分别对3～15种抗生素耐药，其中土霉素、磺胺二甲氧嘧啶、复方新诺明耐药率最高，均为100%(11/11);环丙沙星的敏感率最高，为63.64%(7/11)。说明本次秦皇岛地区分离的犊牛沙门氏杆菌均具有致病性和多重耐药性，血清型以甲型副伤寒沙门氏杆菌为主。
关键词:犊牛腹泻;沙门氏杆菌;致病性;毒力基因检测;耐药性;多重耐药
犊牛腹泻病是肉牛养殖过程中的常见疾病，严重时犊牛发病率可达70%，死亡率达50%[1]。引起该病的原因大致可分为三类，分别为饲养管理因素、遗传因素和病原微生物感染因素，且病原微生物感染被认为是导致犊牛腹泻的主要原因[2]。沙门氏杆菌是一种人畜共患致病菌，也是引起犊牛腹泻的重要细菌性病原之一[3]。沙门氏杆菌感染引起的犊牛腹泻又称牛副伤寒，7～28日龄犊牛易发病，主要临床症状有体温升高，排水样粪便、粪便酸臭、偶见血便，口腔分泌物增加，脱水等;剖检可见小肠包被黏膜样物质，严重时可形成菌血症，侵袭多个器官甚至导致病畜死亡[4-5]。根据菌体抗原、鞭毛抗原和荚膜抗原不同，沙门氏杆菌可分为2587种血清型，对沙门氏杆菌血清分型研究具有重要的流行病学和公共卫生学意义[6]。沙门氏杆菌的致病过程较为复杂，研究发现，毒力因子与沙门氏杆菌致病性密切相关，因此，研究毒力因子有助于了解沙门氏杆菌的致病机理。目前，沙门氏杆菌所致犊牛腹泻病主要用抗生素类药物治疗，但由于抗生素类药物的滥用，导致细菌的耐药性日益严重，因此亟需对致病菌耐药性进行研究并制订合理的用药方案以指导临床用药。笔者对从秦皇岛地区16个肉牛养殖场采集的51份犊牛腹泻样品进行沙门氏杆菌的分离，对分离的沙门氏杆菌进行血清型鉴定、致病性、毒力和耐药性研究，目的是为该地区沙门氏杆菌引起犊牛腹泻病的防治提供技术支持。
1材料与方法
1.1病料
2019年从秦皇岛16个肉牛养殖场采集腹泻犊牛肛拭子，共计51份。
1.2主要试剂
HektonEnteric(HE)琼脂，购自青岛海博生物技术有限公司;革兰氏染色液，购自北京博奥拓达科技有限公司;药敏纸片，购自杭州天和微生物试剂有限公司;ID32E肠杆菌科和其他非苛养革兰氏阴性杆菌鉴定试剂条，均购自法国梅里埃公司;DL-2000Marker，购自中科瑞泰科技有限公司;2×TaqMasterMix、细菌DNA基因组提取试剂盒，均购自康为世纪生物科技有限公司;沙门氏菌属诊断血清，购自兰州生物制品研究所;PCR扩增引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.3试验动物
健康的昆明小鼠60只，体重(20±5)g，购自北京维通利华实验动物有限公司。
1.4细菌的分离鉴定
采用常规方法用HE琼脂分离沙门氏杆菌，挑取有黑色中心的蓝绿色菌落进行纯化培养。将分离纯化的菌株进行革兰氏染色，观察分离菌的形态。参照ID32E肠杆菌科生化鉴定试剂条说明书对分离菌进行细菌生化鉴定试验。用细菌DNA基因组提取试剂盒提取分离菌的DNA并以提取的DNA为模板进行PCR扩增，16SrDNA引物序列、扩增体系及程序参照参考文献[7]，将PCR扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果在NCBI的BLAST分区进行检索并分析。
1.5血清型的检测
采用玻片凝集法检测分离的沙门氏杆菌血清型，试验操作参照沙门氏菌属诊断血清试剂盒说明书进行，将试验结果与说明书中沙门氏菌血清型检索表对照，统计分离菌株的血清型。
1.6致病性试验
参照参考文献[8]中的方法进行致病性试验:将分离菌接种于LB培养基中，置于37℃恒温摇床培养12h，离心弃LB培养基，用灭菌后的PBS重悬菌体，调整浓度至1×107cfu/mL。根据分离的菌株数进行分组，分离的每株沙门氏杆菌为一个试验组，每组5只小鼠，对照组5只小鼠。试验组每只小鼠腹腔注射调整浓度后的菌液0.1mL，对照组每只小鼠腹腔注射0.1mL无菌PBS。注射后观察小鼠状态，记录小鼠发病及死亡情况，剖检死亡小鼠，对分离的各实质脏器进行细菌鉴定。
1.7毒力基因的检测
用细菌DNA基因组提取试剂盒提取分离的沙门氏杆菌DNA，并将其作为PCR扩增模板。沙门氏杆菌毒力基因(mogA、araB、spvD、fimA、sseC、spvA、spvB、sseL、mgtC、hisJ、inaV、sseD、spvR、sseE、bcfA、sscA、spvC、stN、fliC)的引物序列、PCR扩增体系及程序参照参考文献[9-10]进行。PCR检测分离的沙门氏杆菌毒力基因携带情况并记录。
1.8药物敏感性试验
采用KB纸片法检测分离的沙门氏杆菌对兽医临床常用15种抗生素的敏感性，试验操作和结果判定均按照美国临床和实验室标准协会(CLSI)标准(2019年)进行，统计分离菌的耐药谱。
2结果与分析
2.1沙门氏杆菌的分离鉴定
分离菌在HE琼脂培养基上生长出呈蓝绿色、中心有黑点的菌落，初步分离得到11株分离菌;革兰氏染色均为革兰氏阴性杆菌;细菌生化鉴定试验结果表明，11株分离菌均为沙门氏杆菌，符合率为97%～99%;11株分离菌16SrDNA序列测序结果在NCBI的BLAST分区检索分析，结果表明，与沙门氏杆菌参考菌株的基因相似性最高，为99%～100%。从51份腹泻犊牛病料中共分离出11株沙门氏杆菌，分离率为21.57%(11/51)，并命名为NS1～NS11。
2.2血清型的检测
结果表明，11株沙门氏杆菌中，NS1、NS2、NS4、NS8、NS10、NS11为甲型副伤寒沙门氏杆菌，NS5、NS6、NS9为病牛沙门氏杆菌，NS3、NS7为肠炎沙门氏杆菌。
2.3致病性试验
分离的沙门氏杆菌感染小鼠后，小鼠出现腹泻、精神沉郁、呼吸紊乱等症状，甚至死亡，死亡率见表1。剖检死亡小鼠可见肠道气肿、出血，肝脏、肺脏、脾脏肿大。分离实质脏器细菌并鉴定，同样分离到沙门氏杆菌。对照组小鼠无发病及死亡。
2.4毒力基因的检测
11株沙门氏杆菌携带毒力基因情况见表1，各毒力基因检出率见图1。结果表明，NS1～NS11分别携带有3～11种毒力基因，spvA、spvR、stN基因检出率最高，均为63.64%(7/11)，未检出spvB、mgtC基因。
2.5药物敏感性试验
NS1～NS11对各抗生素的敏感性见表2，11株沙门氏杆菌的耐药谱见表3。
由表2、表3可知:11株沙门氏杆菌对OTC、SM2、SXT均完全耐药，耐药率最高，均为100%(11/11);对CIP的敏感率最高，为63.64%(7/11)。11株沙门氏杆菌分别对3～15种抗生素耐药，耐药情况较为复杂。
3讨论
本研究从2019年秦皇岛地区51份犊牛肛拭子样品中共分离到11株沙门氏杆菌，分离率为21.57%(11/51)。喻华英等[11]从塔里木地区12头1月龄腹泻犊牛粪样中分离到5株沙门氏杆菌，分离率为41.7%(5/12)。赵婧[12]从陕西省咸阳市某奶牛场病死犊牛6份病料中分离出5株沙门氏杆菌。说明沙门氏杆菌是致犊牛腹泻病的主要细菌病原之一。有研究表明，B群鼠伤寒沙门氏杆菌、D群都柏林沙门氏杆菌和C2群纽波特沙门氏杆菌是牛副伤寒病的主要血清型[13]。本研究分离的11株沙门氏杆菌以甲型副伤寒沙门氏杆菌为优势血清型，表明不同地区犊牛腹泻沙门氏杆菌的流行血清型不同。
小鼠致病性试验结果表明，本次分离的11株沙门氏杆菌均具有不同的毒力。沙门氏杆菌的致病过程十分复杂，普遍认为毒力因子是影响沙门氏杆菌毒力的重要因素，但在本试验中，毒力基因检测结果与致病性试验结果未显示存在关联性，分析原因可能是沙门氏杆菌毒力基因数量较多，其致病过程是由多种基因、多种机制共同作用的结果。沙门氏杆菌毒力因子包括结构性毒力因子、肠毒素、毒力质粒、毒力岛及Ⅲ型分泌系统等[14]。在本研究中，肠毒素毒力基因stN，毒力质粒毒力基因spvA和spvR检出率最高。肠毒素基因stN在鼠伤寒沙门氏杆菌感染过程中有重要作用，该基因编码的产物可诱发小鼠肠腔液体分泌，但也有研究者从其他血清型沙门氏杆菌中检测到该基因，并发现该基因与耐药性存在一定关系[15-16]。沙门氏杆菌毒力质粒最早被认为是严重全身性感染的非伤寒沙门氏杆菌中普遍存在的与毒力有关的基因，但有研究者从伤寒沙门氏杆菌某些耐药质粒中检测到spv相关基因[17]。spv基因编码产物与沙门氏杆菌血清抗性、黏附定植等毒力表现有关，是沙门氏杆菌在巨噬细胞内生存和繁殖的必需基因，可致使巨噬细胞凋亡[18]。stN、spvA、spvR3个毒力基因检出率较高，表明在秦皇岛地区，这3个基因在分子水平上较为流行，有助于了解该地区犊牛腹泻沙门氏杆菌的致病机制。
牛的养殖周期较长，用药量较大，导致牛源致病菌的耐药情况更为严重。本研究中的11株沙门氏杆菌对3种以上抗生素类药物耐药，其中磺胺类药物耐药率较其他类抗生素更高，而喹诺酮类抗生素的抑菌效果相对较好。由于不同地区饲养方式和用药情况不同，因此分离的沙门氏杆菌耐药情况也不同，如张树栋等[19]分离的致犊牛腹泻沙门氏杆菌对头孢曲松、庆大霉素、头孢拉定、阿米卡星敏感，对阿莫西林、氧氟沙星、诺氟沙星等药物耐药;喻华英等[11]分离的致犊牛腹泻沙门氏杆菌对诺氟沙星、环丙沙星极敏感，对阿莫西林耐药。因此，临床防治沙门氏杆菌感染引起的犊牛腹泻时应对当地流行致病菌株的耐药性进行研究及分析，采用抑菌效果最佳的药物并制订合理的治疗方案，避免抗生素类药物的滥用，减少该病对养殖户造成的损失。
4结论
2019年，秦皇岛地区致犊牛腹泻沙门氏杆菌以甲型副伤寒沙门氏杆菌、病牛沙门氏杆菌、肠炎沙门氏杆菌3种血清型为主，且分离菌对小鼠均具有致病力;毒力基因spvA、spvR、stN检出率最高;分离的沙门氏杆菌对OTC、SM2、SXT耐药率(100%)最高，对CIP的敏感率(63.64%)最高。本研究为秦皇地区沙门氏杆菌感染引起的犊牛腹泻病的防治提供参考。——论文作者：刘勃兴，王利丽，张雪佳，滕文萍，许朝阳，韩黎，史秋梅*，张志强
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