摘要:目的采用形态学方法结合分子生物学方法分析1株临床败血症患者血液分离的念珠状链杆菌(Streptobacillusmoniliformis),为临床罕见致病性病原菌的鉴定提供参考。方法采用革兰染色、DL-96E,VITEK2Compact自动细菌鉴定仪、MALDI-TOFMS质谱仪结合16SrRNA基因序列进行细菌鉴定,同时采用E-test法开展药敏试验。结果传统方法和MALDI-TOFMS无法鉴定出该菌,16SrRNA鉴定出该菌为念珠状链杆菌,药敏试验结果显示该菌对青霉素、头孢噻肟、亚胺培南、四环素和环丙沙星敏感,对氨基糖苷类(妥布霉素)、阿米卡星、庆大霉素和磺胺甲噁唑/甲氧苄啶耐药。结论16SrRNA分子生物学方法结合形态观察和生化反应可以很好地鉴定出念珠状链杆菌,青霉素、头孢噻肟、亚胺培南、四环素和环丙沙星可用于该菌临床治疗。
关键词:念珠状链杆菌;16SrRNA;药敏;青霉素
念珠状链杆菌(Streptobacillusmoniliformis)是一种多形,纺锤形至丝状,无孢子,链状或成团状排列的革兰阴性菌,常定植在啮齿动物上呼吸道,是鼠咬热(Rat-bitefever,RBF)及哈佛山热(Haverhillfever)的主要致病菌[1]。海南省近些年开始有病例报道[2-3]。由于念珠状链杆菌生物学性状不典型,采用常规方法难以鉴定,以往报道的病例主要是基于临床症状结合病史进行推断,无确切的实验室诊断依据。本研究采用传统形态学鉴定和分子生物学技术相结合,对1株该菌开展了形态学观察、生化鉴定,16SrRNA基因序列分析,探索临床念珠状链杆菌的快速准确的检测方法及相应的敏感药物治疗手段。
1材料与方法
1.1菌株菌株分离自一败血症病例,患者女,82岁,因穿鞋刮伤左足背后3d,发热伴畏寒、寒颤入院。入院体格检查:体温高达38℃,心率94次/min,呼吸18次/min,血压130/80mmHg(1mmHg=0.133kPa);全身皮肤黏膜出血点;浅表淋巴结未触及肿大;结膜无充血;双侧扁桃体Ⅱ度肿大;心,肺,腹部检查未见异常;生理反射存在,病理反射未引出,左足背有伤口,伤口已结痂,伤口周围皮肤红肿。本研究经医院伦理委员会审批。
1.2方法
1.2.1细菌培养与鉴定将报阳性需氧血培养瓶标本涂片革兰染色镜检,并接种于哥伦比亚血平皿(安图公司),不加抗生素巧克力血培养皿和专性厌氧血平皿,分别于37℃,5%CO2需氧和厌氧条件下孵育。DL-96E(广州珠海迪尔公司)和VITEK2Compact自动细菌鉴定仪及配套的GN鉴定卡鉴定,试验操作方法按标准作业流程(Standardoperatingprocedure,SOP)进行;基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)质谱鉴定:挑取单个菌落均匀涂抹于靶板,干燥后加1μl基质液,操作按照VITEKMS(InVitroDiagnosis,IVD)3.0质谱鉴定仪SOP进行。
.1.2.216SrRNA基因检测取哥伦比亚血平板上的菌落按WizardGenomicDNAPurificationkit(美国Promega)试剂盒说明书提取基因DNA。16SrRNA扩增通用引物27F-1492R(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'和5'-GGYTACCTTGTTACGACTT-3')(广州天一辉远公司)。反应体系:1μl引物R,1μl引物F,1μlDNA提取物,10×TaqBuffer2μl,dNTP2μl,ddH2O20μl。反应条件:94℃5min,94℃30s,55℃30s,72℃1min,共30个循环;72℃7min。PCR扩增产物直接送天一辉远生物(广州)股份有限公司,经公司纯化后,用序列测定仪ABIPRISMTM377XLDNASequencer进行序列测定。对于正反向序列,用SeqMan(LaserGenSystemSoftware,DNAstarInc.)软件对正向(5'→3')和反向(3'→5')序列进行核对并生成(5'→3')的完整序列。使用DNAstar软件检测序列文件质量,并去除载体和引物序列。使用MAGA7.0软件,采用邻近-连接法(NeighbourJoiningmethod)聚类,生成系统进化树,并用Bootstrap软件对系统树进行检验。以Fusobacteriumnucleatumsubsp.nucleatumATCC25586T(NR074412)作为外群。运用MEGA7.0软件采用Neighbour-joining方法[4]构建基于16SrRNA序列的患者分离株和LPSN网站提供的所有念珠状链杆菌模式菌株模式株和一些相邻菌属的模式菌株系统发生关系图。
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1.2.3药敏试验VITEK2CompactAST-335药敏卡按照SOP方法进行操作;E-test法,试验方法参考厂家说明进行操作。药敏结果参照CLSI[5]标准判读。
2结果
2.1诊断与治疗实验室检查:白细胞计数18×109/L,中性粒细胞百分比90.4%,血小板计数125×109/L,C反应蛋白18.2mg/L,降钙素原1.5μg/L。尿常规,血糖和肝肾功能,凝血功能,肥达+外斐试验和红细胞沉降率等均为阴性。血培养送检需氧厌氧2套进行培养。培养3d后,微生物室电话告知两瓶需氧血培养瓶报告阳性,涂片可见革兰阴性杆菌。血培养后第5天,微生物室报告血培养有念珠状链杆菌生长。根据患者临床表现及实验室检查结果,诊断为念珠状链杆菌感染,败血症。消毒左足背伤口并根据血培养鉴定及药敏试验结果,根据《国家基本药物临床应用指南(化学药品和生物制品)2018年版》[6],给予青霉素160万U,分两次肌内注射,持续一周抗感染治疗,患者无发热,白细胞8.0×109/L,中性粒细胞百分比60.4%,C-反应蛋白3mg/L,降钙素原0.5μg/L。患者左足背伤口周边无红肿,患者恢复,给予出院,出院2周后电话随访无复发。
2.2细菌培养血培养瓶培养3d后报阳,转种哥伦比亚血平板,专性厌氧血平板,不加抗生素巧克力平板。专性厌氧血平板不长,不加抗生素巧克力和哥伦比亚血平板24h后出现针尖状大小,湿润,半透明菌落,无溶血现象;培养48~72h后,菌落直径约1~2mm,半透明、圆形,边缘平滑,湿润,无溶血环,见图1。革兰染色涂阴性,菌体呈链杆状、丝状、部分菌体呈现念珠状肿胀等,见图2。
2.3生化鉴定VITEK2Compact自动细菌鉴定仪、MALDI-TOFMS质谱仪均无鉴定结果;DL96E鉴定卡培养48h后,该菌分解葡萄糖、麦芽糖,产酸不产气;氧化酶和触酶阴性,不分解蔗糖、鼠李糖、乳糖、甘露醇、棉子糖、山梨醇、阿拉伯糖;吲哚、VP试验、硫化氢、七叶苷、明胶水解、赖氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、精氨酸、尿素、枸橼酸盐均阴性。
2.416SrRNA基因测序结果分析经16SrRNA基因扩增后,得到1483bp目的片段,见图3。16SrRNA基因扩增后序列输入(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行Blast分析,显示该菌与念珠状链杆菌具有高度同源性,相似性为99%,见图4。患者分离株与StreptobacillusmoniliformisATCC14647T位于同一分支,见图5,其Bootstrap支持率为100%,由此鉴定该菌为念珠状链杆菌,登录号为MT835239.1。
2.5药敏试验VITEK2CompactAST-335药敏卡片无药敏结果,E-test试条(法国梅里埃公司)扩散法:青霉素(MIC:0.04mg/L),头孢噻肟(MIC:0.01mg/L),头孢曲松钠(MIC:0.03mg/L),亚胺培南(MIC:0.012mg/L),四环素(MIC:0.32mg/L)和环丙沙星(MIC:0.16mg/L)敏感,对氨基糖苷类(MICs:妥布霉素10mg/L),阿米卡星(MIC:32mg/L)和庆大霉素(MIC:4mg/L),和磺胺甲噁唑/甲氧苄啶(MIC:>34mg/L)耐药。
3讨论
RBF是一种人畜共患病,在啮齿动物咬伤或其他接触3天至3周后,出现间歇性或反复性发热,关节炎和皮疹,约75%的人一周内会出现皮疹或紫癜性皮疹,念珠状链杆菌是引起RBF常见的致病菌[7]。海南岛地处热带,近年来陆续出现人感染念珠状链杆菌的病例[2-3,8],提示海南岛存在念珠状链杆菌传染源,需要引起高度重视。
本例患者左足背因为穿鞋被刮伤,表现为伤口红肿,发热等RBF症状。据报道[9-10],接近30%的患者未见有啮齿动物咬伤病史,念珠状链杆菌感染除了啮齿动物直接咬伤外,还可以通过与其唾液、排泄物接触或通过宠物传播。本例患者可能是被沾染了啮齿动物唾液,排泄物的鞋刮伤而感染。血培养3d阳性转种24h后可见细小菌落,同以往报道该菌培养2~7d才可见菌落一致[11]。VITEK2Compact自动细菌鉴定仪无鉴定结果,这可能是由于:VITEK2Compact菌库中未包含该菌谱;该菌的蛋白谱表达较为缓慢,生化反应不活泼。综上,传统的形态学和生化反应等难以鉴定出该菌。近年来,MALDI-TOFMS广泛应用于临床实验室细菌鉴定,国外有学者通过MALDI-TOFMS鉴定出念珠状链杆菌的报道[12],这极大缩短了临床诊治最佳时间,但国内未见报道。本研究MALDI-TOFMS检测为无鉴定结果,可能是因为国内MALDI-TOFMS质谱仪的细菌鉴定菌谱库中尚未包含该菌菌谱,也有可能是念珠状链杆菌在生长过程中,稳定蛋白质尚未完全表达。
随着分子分类学理论和技术的日趋成熟,16SrRNA基因序列分析已逐步成为微生物分类鉴定的一种有效工具,目前已成为细菌种属分类和鉴定的标准方法。在研究细菌进化过程及亲缘关系方面,与传统的表型分类方法相比,16SrRNA序列分析具有的最大优势在于检测速度较快,这是常规细菌鉴定方法无法比拟的。目前,导致人类疾病的许多致病因子均是通过扩增16SrRNA序列,进行分析比对后而被发现的,尤其是一些表型方法鉴定有困难的细菌,用16SrRNA基因序列分析能进行快速准确的鉴定。本文通过16SrRNA基因扩增,测序结果与GenBank数据库比对,结果显示分离菌株与已知StreptobacillusmoniliformisATCC14647T的相似性为100%,由分离株的系统进化树可知,该分离菌与Streptobacillusmoniliform位于同一分支,bootstrap支持率为100%,证实为念珠状链杆菌,登录号为MT835239.1,与前鉴定方法研究[13-14]一致。根据药敏试验结果青霉素、头孢噻肟、亚胺培南、四环素和环丙沙星敏感,与前研究一致[9,11]。由于青霉素毒性小、成本低[15],故本病例中采用青霉素160万U,分两次肌内注射,持续一周治疗患者痊愈,与既往临床治疗该菌推荐青霉素治疗一致[16-17],青霉素可作为临床治疗念珠状链杆菌优选药物。
综上所述,念珠状链杆菌24h可培养出,16SrRNA分子生物学法可以鉴定出该菌。故临床上遇到形态学、生化方法和MALDI-TOFMS鉴定不出的细菌,可以采用16SrRNA分子生物学方法结合形态观察和生化反应进行鉴定。临床疑难菌株的鉴定大大地提高了临床非典型菌诊断的准确性,从而提升临床个体化精准治疗。——论文作者：周晓君1,2,轩断断1,张冠男1,王旭明2,苏屿2,邓垂文3,凌海青4,牛莉娜1
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