本文是由《北京农学院学报》发表的论文，创刊于1987年，是本院主办的综合性农业科学学术刊物。以马列主义、毛泽东思想、邓小平理论、三个代表重要思想为指导，坚持社会主义方向，认真贯彻执行党的有关教育方针和双百方针，坚持实事求是的科学态度，及时反映和报道本院农系园艺畜牧兽医、农业经济、机械学、园林、植物保护、农畜产品贮藏加工、农业生物技术等学科在教学、科研、推广三方面所取得的新进展、新成就、新经验，以促进学术交流、活跃学术气氛为宗旨。为中国生物学文摘等数据库收录，现此期刊正在火热征稿，详情咨询编辑老师。
摘要：本文介绍了DNA分子标记技术，综述了DNA分子标记在苹果品种鉴定、亲缘关系分析、种质资源保存、遗传多样性检测、分子遗传图谱构建、基因标记等方面的应用，并对其在苹果研究中存在问题和应用前景进行了讨论。
关键词：分子标记,苹果,应用
1DNA分子标记技术
随着人类对基因从现象到本质的认识，遗传标记逐步从形态标记、细胞学标记和生化标记发展到能直接反应DNA水平上遗传多态性的DNA分子标记。与经典的遗传标记相比较，DNA分子标记具有不受材料来源和环境的限制，遗传稳定、多态性高、标记位点多、共显性、选择中性、重复性好、检测迅速、操作简便等优势，所以DNA分子标记被视为理想的遗传标记技术，而且迅速得到发展。目前，已有20多种分子标记技术被发展和利用。基于DNA多态性的分子标记技术主要可以分为三类：第一类以传统的Southern杂交为基础，RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism)为代表;第二类以PCR技术为基础，RAPD(RandomlyAmplifiedPolymorphicDNA)、STS(SequenceTaggedSite)、SCAR(SequenceCharacterizedAmplifiedRegion)和AFLP(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism)为代表;第三类以重复序列为基础,SSR(SmipleSequenceRepeat)为代表。
随着分子生物学、遗传学、生物化学等学科理论研究的不断深入和实践应用的不断成功，DNA分子标记技术已被广泛的应用于遗传育种、种质资源鉴定、植物抗病基因定位、植物分类等诸多研究领域。经常应用于果树研究的DNA分子标记有RFLP、RAPD、AFLP、SSR和SCAR等。
2DNA分子标记技术在苹果研究中应用
2.1品种的鉴定
苹果是多年生木本植物，栽培历史悠久,不同地域间的种质交流频繁，导致种质混乱，同名异种现象普遍。传统的形态和同工酶分析方法误差大、效率低，难于对相似的品种进行准确的鉴定。DNA分子标记技术直接从DNA分子水平上对果树品种(系)进行鉴定和分类,准确性更强,效率更高,信息量更大,近几年已得到广泛应用。
Koller等用引物P2(5’ACGAGGGACT3’)成功地区分了11个苹果品种。Tancred等将澳大利亚选育的特早熟品种GB-63-43与其余3个相似品种区分开。祝军等应利用AFLP技术区分了25个苹果品种,用RAPD技术区分了16个苹果品种。周爱琴等用RAPD分析绘制了19个苹果生产上主要砧木的DNA指纹图谱,为苹果砧木的鉴定提供了新的依据。
2.2亲缘关系的确定
苹果中存在许多天然杂种,对一些经实生选种或采用混合花粉杂交选育的品种的亲本无法确定,在品种DNA指纹图谱建立的基础上对其进行聚类分析，可将品种进行分类以鉴定物种起源的亲缘关系。苹果品种津轻是日本1936年以金冠为母本杂交育成,经RAPD结合RFLP分析确认其父本为红玉。乔纳金和陆奥是两个三倍体品种,是金冠分别与红玉、印度杂交而成,RAPD分析表明二者都含有金冠的2n配子。王涛等利用AFLP分析了20个重要苹果砧木间的亲缘关系，聚类分析表明苹果属(MalusMill.)中的两个亚属的砧木被分别聚成两个大组，即花楸苹果亚属(SorbomalusZabel)大组和真苹果亚属(Eu-malusZabel)大组。
2.3种质资源的保存
果树种质资源是为生产提供优良品种的源泉，是果树育种和品种改良的物质基础,因此果树种质资源是人类的宝贵财富。遗传资源的长期保存需要消耗巨大的人力物力，核心种质(corecollection)的概念就是为了尽可能降低消耗而被提出的，利用核心种质理论来长期保存种质资源是提高种质资源管理质量和效率的重要途径，它不但要求对种质的农艺性状进行研究,还要研究它们的遗传变异,以避免重复、减少缺失。Mcferson认为分子标记可以用于核心种质的确定。HokansonS.C.等用SSR结合园艺性状建立了苹果的核心种质。
2.4遗传多样性的检测
遗传多样性一般是指种内的差异水平,它反映着一个物种适应环境的能力及其被改造和利用的潜力。遗传多样性是生命系统的基本特征，也是物种适应自然和发生进化的遗传基础。分子标记产物的多态性反映了被测材料的多样性。分子标记是检测种质资源遗传多样性的有效工具。张开春等用38个随机引物进行RAPD分析,在DNA水平上说明了我国的苹果无融合生殖资源平邑甜茶(Malushupehensis)具有丰富的遗传多样性。
2.5分子遗传图谱的构建
分子标记以其自身的优点成为构建遗传图的主要标记，随着分子标记的发展，遗传图谱己经达到了一定的密集程度，高密度的遗传图谱在很大程度上提高了育种工作的预见性。此外,构建高密度的遗传图谱可为种质资源的保存和基因资源搜集的量化提供科学的依据。刘孟军等对富士和山定子的种间杂交F1代的RAPD标记分离方式进行了研究,为苹果的遗传图谱构建和遗传育种研究提供了参考。第一张完整的苹果遗传图谱是由Hemmat等综合应用同工酶、RFLP及RAPD标记,依RomeBeauty×WhiteAngle组合构建的。
最新的苹果的遗传图谱是Malliepaurd用分子标记及同工酶等多种等位基因标记构建的,该图谱具有较高的标记密度和共显性标记,是苹果上一张较为理想的参考图谱。
2.6基因标记
基因标记是构建遗传图谱、基因定位、克隆和分子辅助育种的前提。目前,已有一批控制果树重要农艺性状的基因被标记并得到广泛应用。ShogoMatsumoto等分析了50多个苹果品种和砧木的自交不亲和等位基因;MinouHemmat利用RAPD标记了苹果黑星病抗病基因Vf;张开春等以平邑甜茶和扎矮76的杂交后代实生苗为试材，获得两个与苹果属显性矮化主基因Dw基因连锁的RAPD标记;王彩虹等以短枝富士和舞美的R1分离群体为试材，筛选到一个与苹果柱形基因Co基因连锁较为紧密的AFLP标记,用PCR的方法对其进行再扩增，实现了此标记片段的克隆和转化。
3问题与展望
DNA分子标记技术己被广泛的应用于植物研究的各个方面，相对来说，果树分子标记起步晚、基础差、发展缓慢。但是，由上述内容可见，分子标记在苹果研究中也取得了不错的成绩。相信随着分子生物学技术的发展，会有更多的分子标记技术被创造和应用。DNA分子标记技术的不断发展与完善，必将为苹果种质资源和遗传育种研究提供新的技术手段,极大地推动我国苹果产业的发展。
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