[摘要] 目的：探讨胶原酶消化法从人脂肪组织中提取脂肪干细胞 (adipose-derived stem cells，ADSCs) 的可行性。方法：采用胶原酶消化法将真空抽脂术抽取的新鲜脂肪组织进行消化分离，获取ADSCs并进行培养，用流式细胞术鉴定ADSCs的表面特异性标志物 CD34、CD44、CD45、CD105的表达。结果：利用胶原酶消化法可成功提取 ADSCs，其标志物 CD44 和 CD105表达阳性，CD34为低表达， CD45表达为阴性。结论：通过胶原酶法可成功提取人ADSCs。
[关键词]人脂肪干细胞;细胞分离;细胞培养;细胞鉴定
脂肪干细胞(adipose- derived stem cells，ADSCs)是 2001 年 Zuk 等[1]从真空吸脂术抽出的脂肪中发 现 的 一 种 间 充 质 干 细 胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，其 含 量 约 占 脂 肪 组 织 的 10% ~ 20%[2]。ADSCs 同其他 MSCs 一样，具有自我更新和多向分化的潜能，是成体干细胞的一种，在疾病治疗领域有巨大的潜力。但 ADSCs 较骨髓干细胞有更高的提取率，其提取率可高达 1%~2%，是骨髓干细胞的 1 000 倍[3]。ADSCs 已成为研究者们青睐的种子细胞，本文就 ADSCs 的提取、培养和鉴定进行研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 脂肪组织 选取滨州医学院附属医院产科剖宫产产妇皮下脂肪组织，产妇无其他基础疾病，未经过特殊药物治疗，取材前均获得医院伦理委员会批准和产妇知情同意。
1.1.2 试 剂 低 糖 DMEM 培 养 基(Gibco，美国)、胎牛血清(FBS，Hyclone，美国)、Ⅰ型胶原酶(索莱宝，中国)、胰蛋白酶(Gibco，美国)、磷酸盐缓冲液(PBS，Hyclone，美国)、青霉素-链霉素(索莱宝，中国)、CD44-FITC 抗体(eBioscience，美 国)、CD105- PE(eBioscience，美 国)、CD34- APC 抗 体(eBioscience，美 国)、CD45- PerCPCyanine5.5 抗体(eBioscience，美国)。
1.1.3 仪器 CO2 培养箱(Thermo Scientific，美国)、生物安全柜(香港力康，中国)、低速多管大容量离心机(上海安亭，中国)、手术器械(新华，中国)、70 μm 细胞筛网(索莱宝，中国)、细胞培养 皿(Corning，美 国)、超 低 温 冰 箱(Thermo Scientific，美国)、流式细胞仪(BD，美国)等。
1.2 方法
1.2.1 ADSCs 提取 (1)将无菌条件下用真空抽脂术提取的腹部皮下脂肪，在生物安全柜内取约 5 g，用含有 500 U/ml 双抗的 PBS 充分漂洗 3 遍，剔除肉眼可见的血管及结缔组织，用眼科剪将其充 分 剪 碎 ，再 用 PBS 反 复 冲 洗 ，尽 量 除 去 红 细胞。(2)加入 2 倍体积的 0.2%Ⅰ型胶原酶，振荡混匀后，于 37 ℃的恒温水浴箱消化 60 min。(3)加入等体积的含有 10% FBS 的低糖 DMEM 培养基终止消化。(4)1 800 r/min 离心 10 min(离心后分为 3 层，上层为油脂及未消化完全的脂肪组织，中层为上清液，下层为脂肪干细胞和红细胞等混合细胞的沉淀)。(5)弃上层和中层，加入 2 ml 完全培养基( 低糖 DMEM +10% FBS +100 U/ml 青霉素-链霉素)重悬细胞沉淀，70 μm 细胞筛网过滤，将滤过后的滤液调整细胞浓度为 1×108 /L 接种至 60 mm 细胞培养皿中，于 37 ℃ 5% CO2细胞培养箱中培养。
1.2.2 ADSCs 培养、传代 将提取的原代 ADSCs 培养 24 h 后进行半量换液，48 h 后进行全量换液，去除残存的红细胞、细胞碎片等。之后每 2 d 换液 1 次，获得纯化后的 ADSCs，培养 7~9 d 后，原代 ADSCs 可生长融合达到 90%，用 0.25%胰蛋白酶(含有 0.2% EDTA)常规消化后，1∶3 传代接种到新的细胞培养皿中持续体外扩增培养。
1.2.3 流式细胞术鉴定 ADSCs 标志物 取第 3 代 ADSCs 鉴 定 细 胞 表 面 特 异 性 标 志 物 CD34、 CD44、CD45、CD105，实验步骤：(1)ADSCs 用胰酶消化后，1 000 r/min 离心 4 min，用 PBS 重悬，计 数 ，每 个 2 ml EP 管 取 细 胞 3 × 105 个 细 胞 ， 1 000 r/min 离 心 4 min，弃 上 清 ，加 入 50 µl 或 100 µl PBS 重悬。(2)细胞与抗体孵育：a. 空白细胞 对 照 组 ：加 入 50 µl PBS;b. 加 入 1 µl CD44- FITC 抗体+99 µl PBS;c. 加入 2.5 µl CD105-PE 抗体+47.5 µl PBS;d. 加入 2.5 µl CD34-APC 抗体 + 47.5 µl PBS;e. 加 入 2.5 µl CD45- PerCPCyanine5.5 抗体+47.5 µl PBS;f. 将上述 4 种抗体分别取 1 µl、5 µl、5 µl、5 µl 加入细胞中+ 84 µl PBS。4 ℃避光孵育 45 min(每隔 15 min 摇晃 1 次)。(3)孵育完后，加入1 ml PBS重悬，1 000 r/min 离心 4 min，弃上清，加入 1 ml PBS 再洗一遍，最终加入 200 µl PBS 重悬。(4)应用流式细胞仪进行检测。
2 结果
2.1 ADSCs 提 取 通 过 胶 原 酶 法 提 取 得 到 了 ADSCs，提取过程见图 1A。提取的原代 ADSCs 生长状况见图 1B- F。ADSCs 呈贴壁生长，随着培养时间的增加，其呈现出纤长的纤维细胞样。
2.2 ADSCs 培 养 传 代 后 的 ADSCs 接 种 24 h 后，细胞已贴壁，呈圆形、短梭形或者多角形，大小不一;待细胞进入增殖期时，ADSCs 逐渐伸展呈现长梭形，排列紧密，呈漩涡状生长，细胞形态与成纤维细胞相似，大小均一，多角形及圆形细胞少见。
2.3 ADSCs 鉴定 成熟后的 ADSCs，用流式细胞术鉴定 ADSCs 的细胞表面特异性标记物，发现 CD44 和 CD105 表 达 阳 性 ，CD34 为 低 表 达 ， CD45 表达为阴性。
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3 讨论
ADSCs 是从脂肪组织中提取出来的具有多能分化潜能的成体干细胞，拥有来源充足、取材方便、操作简单、体外易培养、生物学性状稳定、免疫原性低、不受伦理学限制等优点，因此是组织工程学应用较为广泛的的种子细胞[4]。随着细胞治疗的发展，ADSCs 在治疗、康复、美容等领域均具有较大的应用潜力。ADSCs 作为人体组织工程中最大的成体干细胞库，将成为干细胞应用领域中理想的细胞来源[5]。
ADSCs 提取方法有很多，刘琴等[6]对其提取分离方法进行总结，主要包括了组织块贴壁法、胶原酶消化法、机械分离法(直接离心法、震荡离心法、旋涡离心法、吸附柱法、超声处理法)、胶原酶结合组织块贴壁法、悬浮培养法等，其中胶原酶消化法提取的 ADSCs，其转化成骨的的能力更强[7]。采用胶原酶法消化离心脂肪组织所获得的 沉 淀 称 为 基 质 血 管 成 分(stromal vascular fraction，SVF)，SVF 中除了需要的 ADSCs 外，还有脂肪前体细胞、成纤维细胞、周细胞、基质细胞、内皮细胞、内皮祖细胞、造血干细胞、血管平滑肌细胞、免疫细胞等[3]。因为 SVF 中大多数细胞在培养液中处于漂浮状态无法贴壁[8]，所以胶原酶法提取的 SVF 原代培养 48 h，再经换液后，获得的所有的贴壁活细胞均为 ADSCs[9]。为了进一步鉴定 ADSCs，特异性的标记物是最理想的条件，但是由于各种因素的影响，目前尚未明确 ADSCs 的特异性标记物[10]。2013 年，国际脂肪治疗科学联合会(IFATS)和国际细胞治疗学会(ISCT)联合宣 布 ：ADSCs 新 分 离 的 表 型 为 CD31-/CD34 +/ CD45-/CD235a- ，而 体 外 培 养 表 型 为 CD31-/ CD44+/CD45-/CD73+/CD90+/CD105+[11]，也有研究发现 CD34 为低表达[12-13]。本研究发现，采用胶原酶法可以很好地提取 ADSCs，经过原代培养换液，可以获得较纯的 ADSCs，且经过流式细胞术鉴 定 后 ，发 现 其 表 面 标 志 物 为 CD34 +/CD44 +/ CD45-/CD105+，其中 CD34 为低表达。
通过本研究发现，采用消化酶法可以成功提取 ADSCs，且其性状相对稳定，易于培养。通过流式细胞术鉴定其表面标记物，可证明本研究提取的细胞为 ADSCs。用此方法可以较便捷地提取 ADSCs，便于后续的转化分析的研究。
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