【摘要】目的通过免疫组化及生育力评估的手段进一步探讨宫腔注入95%乙醇建立一个稳定的薄型子宫内膜小鼠模型的可行性，为薄型子宫内膜的病理特征及修复机制的相关研究提供理想的动物模型。方法选择78只性成熟且动情期规律的雌性C57BL/6J小鼠作为实验动物，通过宫腔注入95%乙醇损伤子宫内膜建立薄型子宫内膜小鼠模型。将78只实验小鼠随机分为两大组，其中一组30只，又随机分为空白组，对照组和实验组，于造模后第三个动情期将实验小鼠颈椎脱臼法处死，收集子宫样本，免疫组织化学检测细胞角蛋白、波形蛋白、血管内皮生长因子和雌激素受体α的表达以评估子宫内膜细胞的再生情况;另一组48只，又随机分为空白组，对照组，单侧损伤组和双侧损伤组，造模后所有存活小鼠于第三个动情期进行合笼交配，分析薄型子宫内膜对小鼠生育力的影响，评估薄型子宫内膜小鼠模型是否建立成功。结果免疫组织化学结果显示，宫腔注入95%乙醇的实验组小鼠子宫内膜细胞角蛋白、波形蛋白、血管内皮生长因子和雌激素受体α的表达均显著低于空白组和对照组。生育力评估实验显示合笼交配后，空白组和对照组小鼠正常受孕，双侧损伤实验组小鼠未受孕，单侧损伤实验组损伤侧子宫未受孕，未损伤侧子宫正常受孕，且损伤侧子宫的平均怀孕率较未损伤侧显著降低(P<0.05)，表明宫腔注入95%乙醇能够损伤小鼠子宫内膜，导致生育力降低。结论本研究成功建立了薄型子宫内膜小鼠模型，该模型可用于薄型子宫内膜修复及修复机制的研究。
【关键词】薄型子宫内膜;小鼠模型;免疫组化;生育力评估
薄型子宫内膜大大影响子宫内膜容受性，导致胚胎着床失败，或不能维持继续妊娠，是生殖医学领域中的难题之一[1]，且薄型子宫内膜作为一个重要的易检测临床指标，受到了广大妇科医生的关注。临床一般认为，薄型子宫内膜患者黄体期子宫内膜厚度<7mm，适宜的子宫内膜厚度(8～14mm)，会大大增加受精卵着床的可能性[2]。目前，对薄型子宫内膜病因猜测甚多，但临床尚无明确诊断，也很少能直接获得可供研究的人体组织标本[3]。因此，建立接近的薄型子宫内膜动物模型并进行相关研究，是科研工作者能想到最为合适的方法。
目前国内外关于子宫损伤的动物模型案例非常多样化，动物选择包括牛、猪、猕猴、比格犬、兔、大小鼠等，损伤方法也有机械损伤、电热损伤、化学试剂损伤以及多种方法联合损伤等[4-10]。但目前关于薄型子宫内膜的造模方法仅有一种，即利用高浓度乙醇的脱水及蛋白质变性作用，宫腔注射95%乙醇构建薄型子宫内膜大鼠模型[8-10]，参考该方法及本课题组的初步研究[11]，通过小鼠宫腔内注射95%乙醇建立了薄型子宫内膜小鼠模型，并已通过子宫内膜厚度，HE染色等方面的鉴定证明造模初步成功。但造模成功率较低，且鉴定较为片面，仍需进一步完善。
在前期实验的基础上，本实验对造模方法进行适当的优化，建立薄型子宫内膜小鼠模型，并予以更加全面的结构和功能方面的鉴定，为深入了解薄型子宫内膜的病理特征及寻求有效的治疗方法提供理想的动物模型。
1材料和方法
1.1实验动物
6～8周龄SPF级性成熟且未交配C57BL/6J雌性小鼠78只，体重19～22g;10周龄SPF级，预实验已确定有生育能力的C57BL/6J雄性小鼠30只，体重22～25g。由山西医科大学实验动物中心提供[SCXK(晋)2015-0001]。饲养条件:山西医科大学实验动物中心屏障环境动物实验室[SYXK(晋)2015-0001]，每5只一笼，温度(25±2)℃，湿度(55±2)%，光照明暗时间比为12h/12h，自由获取食物和水。本实验操作遵循实验动物伦理学要求(伦理审批号:IACUC2017-004)。
1.2主要试剂与仪器
戊巴比妥钠(CeresChemical)、无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)、生理盐水(山东华鲁制药有限公司)、伊红(Bioswamp)、苏木素(Bioswamp)、甲醛(国药集团化学试剂有限公司)、中性树脂(Bioswamp)、二甲苯(国药集团化学试剂有限公司)，3%H2O2(国药集团化学试剂有限公司)、DAB浓缩试剂盒(Bioswamp)、pan-cytpkeratin(H-240):sc-15367(Santa)、ERα(hc-20):sc-543(Santa)、monoclonalanti-vimentin:V-6630(Sigma)、VEGFantibody(VG-1):ab1316(Abcam)。
研究级正置显微镜(OlympusIX51)、组织脱水机(湖北康强医疗器械有限公司)、石蜡包埋机(湖北泰维科技视野有限公司)、石蜡切片机(徕卡显微系统有限公司)、摊片烤片机(湖北康强医疗器械有限公司)、IMS图像分析系统(武汉华联科生物技术有限公司)，恒温烘箱(上海恒益科学仪器有限公司)。
1.3实验方法
1.3.1实验分组
所有实验动物分为两组。第一组小鼠30只，随机分为空白组，对照组和实验组，每组10只。于第三个动情周期的动情期当日进行造模实验，造模后的第三个动情期针对角蛋白，波形蛋白，血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)和雌激素受体α(estrogenreceptorα，ERα)进行免疫组化鉴定。第二组48只，随机分为空白组，对照组，单侧损伤组和双侧损伤组，每组12只。造模后第三个动情期进行合笼交配，根据妊娠情况对薄型子宫内膜小鼠模型的生育力进行评估。
1.3.2薄型子宫内膜小鼠模型的建立
95%乙醇具有迅速使细胞脱水及蛋白质变性的作用，可深入损伤子宫内膜基底层。基于本课题组的初步研究[11]，建立薄型子宫内膜小鼠模型。
本次实验过程优化步骤:(1)整个手术过程以及术后小鼠的苏醒在动物保温台上进行;(2)手术过程选用弯钩无损伤眼科镊;(3)于靠近宫颈处插入1mL注射器，尽量使子宫内膜损伤完全且均匀，并防止注射针穿透子宫导致药物外漏;(4)宫腔注入95%乙醇时，用无菌纱布保护周围组织，特别是膀胱及肛门附近区域。
1.3.3标本收集
第一组造模后全部存活小鼠进行免疫组化检测实验。其中空白组与对照组在造模过程中无小鼠意外死亡，实验组2只小鼠死亡。于第三个动情期，将造模后所有存活小鼠颈椎脱臼法处死，取出子宫并置于4%多聚甲醛(PFA)中，待下一步研究。
1.3.4免疫组织化学鉴定
将术后所获子宫组织垂直包埋，切为大小1.5cm×1.5cm×0.3cm的标本，切好的组织块置于10%福尔马林中固定48h，随后依次置于不同浓度的乙醇中逐级脱水，每级2h。将组织块进行透明处理、浸蜡后，再进行包埋，切片，最后进行免疫组化染色。
角蛋白、波形蛋白在0.01mol/L柠檬酸钠缓冲溶液中进行高压抗原修复，大火沸腾后中火10min较为适宜，ERα为中火20min，VEGF在1LEDTA抗原修复液中进行修复，同样为大火沸腾后中火10min。3%H2O2中湿盒孵育10min，消除内源性过氧化物酶的活性，并在补充有10%正常山羊血清的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中封闭1h。然后，将组织切片与针对细胞角蛋白(1∶50)，波形蛋白(1∶200)，VEGF(1∶150)及ERα(1∶100))的一抗一起4℃孵育过夜，添加maxvision二抗，37℃静置30min，DAB染色，苏木精复染，烘干后透明，封片。最后，使用显微成像系统，每个切片在高倍率(×400)下随机选取三个区域以获得子宫内膜的免疫组织化学切片图像。通过对细胞角蛋白、波形蛋白、VEGF和ERα的免疫组化检测来分析子宫内膜细胞的再生情况，采用平均光密度法，平均光密度(AODmeandensity)=IOD(integratedopticaldensity)累积光密度/area，并进行组间的分析比较。
1.3.5生育力评估
第二组造模后全部存活小鼠进行生育力评估实验。其中空白组与对照组在造模过程中无小鼠意外死亡，实验组II(单侧损伤)1只小鼠死亡，实验组I(双侧损伤)3只小鼠死亡。所有存活小鼠于第三个动情期的每天下午5:30同时与雄性小鼠以雌雄2∶1的比例进行合笼交配。每天早上08:00观察阴栓，以确定是否成功交配。
若交配成功，即将雌、雄小鼠分开饲养，并进行标记。若交配不成功，继续合笼，但合笼大约一周后，停止合笼。观察到阴栓约16d后，将雌性小鼠颈椎脱臼处死以确定怀孕情况。暴露子宫，观察小鼠子宫妊娠情况，如胚胎数量、胚胎颜色等，拍照、记录，并进行组间统计学分析。
1.4统计学分析
采用SPSS16.0软件进行统计学分析。计量资料以平均数±标准差(x±s珋)表示，P值表示双侧概率，方差齐的两组比较采用方差分析，t检验确定组间差异显著性。以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1免疫组织化学鉴定
三个动情周期后，通过免疫组织化学检测各组子宫内膜细胞角蛋白、波形蛋白、VEGF和ERα的表达。免疫组织化学染色根据待检测蛋白与其抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色，来确定组织细胞内抗原及其含量，显色面积与抗原量成正相关。免疫组织化学结果显示实验组细胞角蛋白、波形蛋白、VEGF和ERα的平均光密度值(averageopticaldensity，AOD)明显低于空白组和对照组(P<0.05)，但空白组与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)(见图1～4)。
2.1.1子宫内膜细胞角蛋白的表达
角蛋白，对维持上皮细胞的形态完整性有重要作用，主要表达于子宫内膜腺上皮和腔上皮细胞中(见图1A-C)，细胞角蛋白表达量的高低反映了子宫内膜上皮细胞的生长情况。空白组与对照组间细胞角蛋白的AOD差异无统计学意义(P>0.05);然而，与空白组和对照组相比，实验组的AOD显著降低(P<0.01)(见表1)。
2.1.2子宫内膜细胞波形蛋白的表达
波形蛋白存在于中胚层起源的细胞中，是间质细胞中最主要的中间纤维，主要表达于基质细胞的胞质中(见图2A-C)，波形蛋白表达量的高低反映了子宫内膜基质细胞的生长情况。免疫组化结果显示，空白组与对照组间波形蛋白的AOD差异无统计学意义(P>0.05);然而，与空白组和对照组相比，实验组的AOD显著降低(P<0.01)(见表2)。
2.1.3子宫内膜VEGF的表达
VEGF是目前已知的促血管生成的重要细胞因子，主要表达于子宫内膜、腺体和血管内皮细胞的细胞质中(见图3A-C)。如表3所示，空白组与对照组间VEGF的AOD差异无统计学意义(P>0.05)。然而，与空白组和对照组相比，实验组VEGF显示出明显较低的AOD，且差异具有显著性(P<0.01)(表3)。
2.1.4子宫内膜ERα的表达
雌激素是调节子宫内膜生长的主要激素，而雌激素受体是雌激素对子宫内膜发生作用的桥梁。ERα主要表达于子宫内膜腺上皮和腔上皮细胞的胞核和胞浆中，胞核表达大于胞浆，基质细胞中也有表达(见图4A-C)。如表4所示，空白组与对照组间ERα的AOD差异无统计学意义(P>0.05)。然而，与空白组和对照组相比，实验组ERα显示出明显较低的AOD，且差异具有显著性(P<0.01)(表4)。
2.2生育力评估
生育力是检验子宫功能的重要指标，生育力评估实验也是用于进一步验证薄型子宫内膜小鼠模型是否建立成功的关键方法。
造模过程中，由于实验操作或化学试剂等影响，空白组和对照组无小鼠意外死亡，实验组II(单侧损伤)一只小鼠意外死亡;而实验组I(双侧损伤)三只小鼠意外死亡。将造模后所有存活小鼠进行合笼交配用于生育力评估实验。生育力评估结果显示，手术损伤侧子宫的平均怀孕率明显低于对侧(未损伤侧子宫)(P<0.01)(见表5)。
空白组8只小鼠怀孕，怀孕率为66.7%(与文献资料接近)[12]，子宫两侧均见胚胎，且胚胎质量良好(见图5A);对照组小鼠怀孕情况与空白组相同(见图5B);实验组II有7只小鼠怀孕，怀孕率为63.6%，胚胎位于未损伤一侧子宫，且靠近宫颈部位的胚胎较小，发育不良，考虑可能是由对侧子宫注入的95%乙醇的渗入导致。同时，损伤侧子宫未见受孕(见图5C);实验组I中仅一只小鼠怀孕，怀孕率为11.1%。子宫体形态不规则，粗细不均，子宫颜色发白或发黄，且局部有出血点。(见图5D)。
生育能力评估结果显示，空白组与对照组比较，小鼠的怀孕率差异无统计学意义(P>0.05)。但与其他三组比较，实验组Ⅰ小鼠的怀孕率显著降低(P<0.01)。同时，与空白组和对照组相比，实验组II整体怀孕率差异具有统计学意义(P<0.05)，但损伤侧和未损伤侧子宫的怀孕率之间存在显著性差异(P<0.01)(见表5)。
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