摘 要: 探究大熊猫核糖体蛋白基因 RPL35A 及其编码蛋白的特点，以进一步研究其编码蛋白的功能，为深入开展大熊猫分子生物学研究及大熊猫基因保护等积累科学资料; 本研究以大熊猫骨骼肌为材料，采用 RT-PCR 和降落- PCR 方法克隆 RPL35A 基因的 cDNA 基因组序列，IPTG 法诱导基因在 BL21 细胞系中的表达; 大熊猫 RPL35A 基因的 cDNA 序列为 337 bp，编码 110 个氨基酸; 该基因的基因组序列长 1 275 bp，包含 2 个外显子和 1 个内含子; RPL35A 基因在 BL21 细胞系中的表达产物与组氨酸标签蛋白融合形成 18 kDa 的融合蛋白; 该基因的 cDNA 序列、基因组序列中的外显子片段及其编码的蛋白序列与已报道的人、牛、小家鼠、褐家鼠等物种的对应序列同源性很高，蛋白质理化性质和功能位点基本相同，这说明该基因及其编码蛋白在进化过程中非常保守，可用于分子进化方面的研究，在物种进化关系研究中具有一定的参考意义和研究价值; 同时，该基因可在原核生物中表达出具有活性的产物，可进一步开展纯化和蛋白质功能的研究。
关键词: 大熊猫; RT-PCR; 降落-PCR; RPL35A; 克隆; 表达
0 引 言
核糖体的大小亚基约由 80 种核糖蛋白构成，对核糖蛋白的研究一直是遗传学和分子生物学研究的重要领域[1-2]。核糖体蛋白 L35A 基因( 简称 RPL35A) ，位于 3 号染色体的 q29-qter 区段，编码大亚基中的核糖体蛋白 L35AE 家族中的 RPL35A 蛋白。在小鼠中，该蛋白位于核糖体中的 P 位和 A 位或完全位于 P 位，与启动因子及延伸因子相结合参与核糖体的翻译活动[3-4]。
大熊猫( Ailuropoda melanoleuca) 是极其宝贵的自然历史遗产，具有重要的学术研究价值，但属于高度濒危物种，被列入《中国国家重点保护野生动物名录》Ⅰ级、《华盛顿公约》CITESⅠ级保护动物和《世界自然保护联盟》( IUCN) 2016 年濒危物种红色名录 ver 3. 1— 易危( VU) 。多年来，对大熊猫传统的研究和保护工作局限于大熊猫生态、分类、饲养、繁育、疾病等方面[5-7]; 近年来，研究重心多集中在遗传多样性、亲子关系鉴定以及系统发育等遗传学领域; 目前，从分子水平研究、保护大熊猫的基因资源成为研究重点和热点领域[8-18]，为破解大熊猫繁殖力低下难题，提高人工繁育大熊猫能力提供新的途径。本研究以大熊猫骨骼肌为材料，克隆出核糖蛋白基因 RPL35A 的 cDNA 序列和基因组序列，对其进行诱导表达; 并对克隆序列及其编码蛋白的特性进行详细的比较分析，为进一步研究 RPL35A 蛋白的功能打下基础，也为更深入开展大熊猫分子生物学研究和推进针对大熊猫其他方面的科学研究积累科学的资料。
1 材料与方法
1. 1 实验材料与试剂
大熊猫骨骼肌组织取自四川卧龙中国保护大熊猫中心死亡的大熊猫。
总 RNA 抽提试剂盒、逆转录试剂盒、胶回收试剂盒、Taq DNA 聚合酶、PUC18 载体试剂盒、限制性内切酶 EcoRⅠ、HindⅢ 购自深圳市宝安康生物技术有限公司; 引物由金斯瑞生物技术有限公司合成; 其它试剂均为国产分析纯。
宿主菌为 E. coliJM109，由本实验室保存。
1. 2 方 法
1. 2. 1 提取 RNA
取适量肌肉组织迅速放于液氮中充分研磨，然后利用总 RNA 抽提试剂盒提取总 RNA，用于后续反转录实验。
1. 2. 2 引物设计
检索 Genbank 中已报道的人( Homo sapiens) ( NM_000996. 2) 、牛( Bos Taurus) ( NM_001025321. 2) 、褐家鼠( Rattus norvegicus) ( NM_021264. 3) 及小家鼠( Mus musculus) ( NM_001130484. 1) 的 RPL35A 的编码序列作为依据，设计引物:
前引物为 5'-TATGTCTGGAAGGCTGTGGT -3';
后引物为 5'-AGTTTAAATCCGTGAAGGGT -3'
1. 2. 3 cDNA 克隆
采用 20μL 反应体积合成 cDNA 第一链: 约 1 μg RNA 模板，0. 5 μg Oiligo( dT) 15 引物，15 U AMV 反转录酶，1 mM dNTPs，10 U/μL RNA 酶抑制剂，5 mM MgCl2 ; 反转录温度为 42 ℃，时间为 1 h。
再采用 25 μL 的反应体系进行 PCR 扩增反应: 适量的 cDNA 第一链模板，所设计的前后引物各 0. 3 μM， 200 μM dNTP，1. 5 mM MgCl2，5 U Taq DNA 聚合酶进行聚合酶链式反应( PCR) ; 反应条件如下: 94 ℃，3 min; 94 ℃，1 min; 45 ℃，0. 5 min; 72 ℃，1. 5 min，30 个循环，72 ℃，10 min; 反应结束后，用 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物。
回收并纯化产物，与酶切好的 pET28a 质粒置于 22 ℃下 12 h 进行连接反应。
常规法转化 E. coliJMl09 感受态细胞，煮沸法提取质粒，用 EcoRⅠ、HindⅢ进行双酶切，最后 PCR 鉴定重组质粒并选取重组质粒培养，送出测序。
1. 2. 4 RPL35A 基因组序列克隆
采用前述引物，应用降落-PCR 进行扩增反应，反应条件如下: 第 1 个循环 94 ℃ 30 s，62 ℃ 45 s，72 ℃ 4 min; 后续反应每经过一次循环降低 1 ℃，共 20 个循环; 然后再进行 15 个循环: 94 ℃ 30 s，52 ℃ 45 s， 72 ℃ 4 min。鉴定并送出测序。
1. 2. 5 RPL35A 基因的诱导表达
本实验采用 IPTG( isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside) 诱导 RPL35A 基因表达，分别在诱导培养 0、0. 5、 1. 5、2、2. 5、3 和 3. 5 时各收集 1 mL 菌液，分别加入 100 μL 含溴酚蓝的蛋白提取液，100 ℃变性 5 min; 4 ℃， 10 000 rpm /min 离心 5 min，取上清; 取 40 μL 上清液进行 SDS-PAGE[13]，检测该蛋白是否与理论大小相符。
2 结 果
2. 1 提取的总 RNA
按 RNA 提取试剂盒的推荐方法提取总 RNA，电泳条带清晰明亮，表明所提 RNA 质量良好，可用于反转录。
2. 2 RPL35A 基因 cDNA 序列及测序
将所克隆 RPL35A 基因的 cDNA 序列进行电泳，显示在大约 300 bp 处有一条明亮的条带( 图 1) ，符合预期长度。将测序结果用 Blast 检索，发现该序列与已报道的 RPL35A 基因序列的同源性很高，这表明克隆产物就是大熊猫 RPL35A 基因的 cDNA 序列。该序列已提交 GenBank 数据库( bankit1393572) 。
2. 3 RPL35A 基因组序列及测序
将所克隆 RPL35A 基因的基因组序列进行电泳，在大约 1 200 bp 处显示有一条明亮的条带( 图 2) ，与预期长度相符。将测序结果与 cDNA 序列比对，cDNA 序列与该基因 2-165; 1104-1272 两个片段完全相符，这表明该克隆产物就是大熊猫 RPL35A 的基因组序列。该序列已提交 GenBank 数据库( bankit1393573) 。
2. 4 RPL35A 基因的诱导表达
诱导 RPL35A 基因在 BL21 细胞系中的表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，RPL35A 蛋白与组氨酸标签蛋白融合形成 18 kDa 的融合蛋白( 图 3) 。
3 讨 论
3. 1 基因序列的保守性
对克隆的大熊猫 RPL35A 基因的 cDNA 序列测序结果进行分析，发现大熊猫 RPL35A 的 cDNA 序列 ORF 为 333 bp。将其分别与报道的人( Homo sapiens) 、牛( Bos taurus) 、褐家鼠( Rattus norvegicus) 、小家鼠( Mus musculus) 的 RPL35A 基因的编码序列进行比对可知，编码序列同源性在 90% 以上( 表 1) 。
对克隆的大熊猫 RPL35A 基因的基因组序列测序结果进行分析，发现该序列包含了 2-165 和 1104-1272 两个外显子，与已报道的人、牛、小家鼠及褐家鼠 RPL35A 基因的序列比对发现，外显子在不同物种中的数目和分布位置都存在一定差异( 表 2) ，但外显子片段的同源性高达 90% 以上。上述分析表明该基因的编码序列高度保守，能真实地反应物种间的进化关系，在物种进化研究中具有一定的参考意义和研究价值。
3. 2 蛋白质一级结构的保守性
大熊猫 RPL35A 蛋白由 110 个氨基酸，利用 Proteomics Server 软件对其分析发现: 该蛋白质序列中包含 27 个带正电荷的氨基酸残基( 精氨酸、赖氨酸和组氨酸) ，5 个带负电荷的氨基酸残基( 谷氨酸和天冬氨酸) ，其余氨基酸均为中性。将其分别与人( Homo sapiens) 、牛( Bos taurus) 、小家鼠( Mus musculus) 及褐家鼠( Rattus norvegicus) 的 RPL35A 的氨基酸序列比对可知，RPL35A 基因编码的氨基酸序列在不同的物种中同源性很高，可达 99% 以上( 表 1) 。
3. 3 RPL35A 蛋白的二级结构
利用 APSSP2 软件分析 RPL35A 蛋白质的二级结构显示，27. 27% 的氨基酸序列以伸展片带形式存在， 40. 00% 的氨基酸序列以 α 螺旋形式存在，32. 73% 的氨基酸序列以折叠无规卷曲形式存在( 表 3) 。进一步比较分析发现，该蛋白的二级结构的存在形式及其所占比例在 5 个物种间差异非常小。
3. 4 蛋白质高级结构的功能位点
利用 Proteomics Server 软件对大熊猫 RPL35A 蛋白高级结构预测分析发现: 该蛋白含有 5 种类型共 7 个功能位点: 即 2 个 N-糖基化位点、1 个蛋白激酶 C 磷酸化位点、1 个酰胺化位点、2 个 N-酰基化位点及 1 个 C 末端靶向信号位点。进一步比较分析发现，大熊猫与另外四个物种的该蛋白质功能位点的数量、类型及分布位置均一致( 图 4) 。
进一步分析图 5 可知，上述物种中该蛋白序列在各功能位点内部无任何氨基酸序列的变异，这表明该蛋白质的功能极其保守; 而仅仅在功能位点外的第 7 位氨基酸的构成上有差异，从功能位点的种类和分布来看，该差异并没有对该蛋白的主要功能造成影响，但是否会对蛋白结构等产生影响还有待进一步研究。
对该蛋白质的分子量及等电点进行预测，发现该蛋白质分子量为 12. 535 5 kDa，pI 为 11. 63，且各物种中该蛋白的分子量和等电点都十分接近( 表 3) 。 Feo S 和 Colombo P 的研究表明，RPL35A 蛋白是核糖体小亚基中的 P 位和大亚基的 A 位组成部分，在蛋白质翻译过程中可与启动因子及延伸因子相结合，对于核糖体执行蛋白质工厂的功能至关重要[3-4]。本研究一系列讨论结果表明 RPL35A 蛋白的理化性质和功能位点在哺乳动物中高度保守，由此可推测该蛋白在大熊猫中的具体功用很可能与其他哺乳动物类似。
3. 5 RPL35A 基因的超表达
RPL35A 基因的超表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析电泳图谱发现，该基因在经 IPTG 诱导 0. 5 h 后开始表达，2 h 后达到了最高表达水平，这表明 RPL35A 基因在 BL21 细胞系中可以表达，且表达出的蛋白质具有活性; 表达产物将提纯并进一步用于该蛋白质的功能研究，以明确该蛋白在大熊猫核糖体中的具体功用。
由上述讨论可知 RPL35A 基因及其编码的蛋白序列高度保守，这一结论表明该基因及其编码蛋白能真实地反应物种间的进化关系，可用于分子进化方面的研究，在物种进化关系的研究中具有一定的参考意义和研究价值; 同时，该基因可在原核生物中表达出具有活性的产物，这表明可在该基因克隆和表达研究工作的基础上进一步开展蛋白质功能的研究，以明确该蛋白在大熊猫核糖体中的具体功用，从而为从基因水平保护大熊猫提供科学依据。
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