摘要：目的 制备黄芪多糖联合阿霉素脂质体，研究共载脂质体的抗肿瘤作用。方法 乙醇注入法制备肝靶向共载脂质体，检测其理化性质。细胞学分析共载脂质体的细胞摄入和细胞毒性特征。结果 黄芪多糖联合阿霉素脂质体粒径为 168.9nm，较均一 , 能被 HepG2 细胞有效摄入，细胞毒性实验显示，共载脂质体组具有较强的抗肿瘤效果。结论 中药多糖与化学药物联合，抗肿瘤效果好，对机体的损害程度低，具有一定的研发前景。
关键词：阿霉素;黄芪多糖;脂质体;肝靶向
0 引言
黄芪多糖来自黄芪，其主要生物活性表现为增强免疫功能、脾脏增大、抗流感、抗肿瘤、防衰老及抗辐射等功效，黄芪多糖具有多种生物活性及良好的临床效果 [2]。阿霉素是一种蒽环类抗生素，能够嵌入到 DNA 的碱基对之间并与 DNA 紧密结合，抑制基因的转录和复制，对 RNA 的抑制作用最强，抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。脂质体联合给药抗肿瘤效果好、靶向性好、毒副作用低、耐药性低。本实验将黄芪多糖与阿霉素联合制备肝靶向脂质体，对该合成药物的药效学进行分析，证明该黄芪多糖联合阿霉素复方制剂可调节机体的免疫功能，抑制肿瘤转移，为进行创新药物的研究和开发奠定基础 [3-4]。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
黄芪多糖购自上海源叶生物科技有限公司，盐酸阿霉素(DOX·HCl)购自上海伊卡生物技术有限公司，磷脂、胆固醇购自 Solarbio 公司，胎牛血清购自浙江天航生物科技有限公司，RPMI Medium 1640 培养基购自 Solarbio 公司，胰蛋白酶购自 Amresco 公司。其他试剂均为分析纯。
1.2 实验细胞和动物
HepG2 细胞购自武汉大学生命典藏中心，H22 细胞由山东省应用药理学重点实验室惠赠。SPF 级昆明种小鼠，雄性， 6~8 周龄，体质量(18±2)g，购自潍坊医学院实验动物中心。
1.3 实验方法
1.3.1 黄芪多糖联合阿霉素脂质体的制备
取 卵 磷 脂、胆 固 醇 及 肝 靶 向 材 料(DSPE-PEG-GA，GA 为甘草次酸)溶于乙醚中，黄芪多糖溶于 PBS 中，两者混合后加入阿霉素 [1]，并匀速注入水浴 65℃，20mL 的 PBS 中，放到恒温磁力搅拌器上缓慢匀速搅拌，过 0.8μm 滤膜。避光静置 24 小时后，再用蒸馏水透析 48 小时后，冻干保存 [5]。
1.3.2 共载脂质体的理化性质分析
用 Nano-ZS90 型马尔文粒度仪，测定黄芪多糖联合阿霉素肝靶向脂质体的粒径分布和 Zeta 电位。测定条件的设定：角度为 90°、波长 633nm、重复 3 次、控制温度在 25℃ [6]。将黄芪多糖联合阿霉素脂质体样品滴加到封口膜上并置于铜网上，分别吸取 30ul 磷钼酸于封口膜染色，电镜下观察形态。用 UV-5500 型紫外可见光分光度计，设定波长为 480nm，测定阿霉素载药量。抗氧化方法测脂质体中黄芪多糖含量 [7]。
1.3.3 细胞学分析。
96 孔培养 HepG2 细胞，贴壁后加入 200μL 不同浓度的药物(阴性对照组不加药物)，继续培养 48h。加入 MTT 和二甲基亚砜溶液，在 570nm 处测量并记录各孔的吸光度及其吸光值，计算细胞的存活率。6 孔板培养 HepG2 细胞，贴壁后加入不同浓度的药物，CO2 培养箱培养 2h。固定后用 DAPI 染色，荧光显微镜下观察并拍照记录 [8-9]。
2 结果
2.1 共载脂质体理化性质分析
透射电镜显示(图 1A)，制得的黄芪多糖联合阿霉素肝靶向脂质体近似于圆球形，样品比较均一，分散性良好。粒径分布结果显示(图 1B)，共载脂质体的平均粒径为 168.9nm，多分散性为 0.144。
2.2 共载脂质体的细胞摄入分析
荧光显微镜显示(图 2)，共载脂质体与细胞共培养 2h，细胞质发出红色荧光，表示载药脂质体已被细胞摄入。合并图可以看出，细胞核区域发出红色荧光点，表示一部分阿霉素已到达细胞核中。结果表明载药脂质体能很好地被细胞摄入并聚集在细胞核区域。
2.3 细胞毒性分析
空载脂质体对 HepG2 细胞的毒性如图 3A 所示，在脂质体浓度为 1000μg/mL 的高浓度下，细胞的存活率仍然高达 90% 以上，表明空白脂质体材料没有明显的肿瘤细胞毒作用。从图 3B 可以看出，随着药物浓度的增加，共载脂质体与单载脂质体对细胞的抑制率均有明显增高，细胞存活率随着药物浓度增加而降低，但共载脂质体的抑制效果更加明显，这说明共载脂质体具有更强的抗肝癌效果 [10]。
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3 讨论
化疗是肝癌的常规的治疗方法，但毒副作用强。黄芪多糖是黄芪中的有效成分，能调节机体免疫功能，广泛应用于抗肿瘤、病毒等方面。本试验制备了黄芪多糖联合阿霉素靶向脂质体，并测定了该脂质体的理化性质，制得的脂质体粒径均一，分散性良好。黄芪多糖联合阿霉素脂质体的体外抗肿瘤抗癌研究分析：①细胞摄入试验表明共载脂质体可被人肝癌细胞摄入，并在细胞核处聚集;② MTT 检测显示共载脂质体与其他组药物相比能有效且高效抑制肝癌细胞的生长增殖，并且表现出一定的剂量依赖性 [11-12]。
本实验所制备的黄芪多糖联合阿霉素肝靶向脂质体，作为一种化学药物与中药多糖联合并以脂质体为载体的新剂型，不仅提供了抗肝癌的新处方，还能实现脂质体的靶向给药，提高了药物的生物利用度，具有很好的发展前景，有望被临床应用和开发。
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