摘要：建立一种简易快速、特异性高的胶体金免疫层析法(GICA)用于检测肺炎链球菌细胞壁多糖抗原(C-Ps).根据双抗体夹心原理，将C-Ps单克隆抗体标记于胶体金颗粒，建立检测方法.实验结果表明该试纸条操作简便，肉眼于15,min内即可判定结果.试纸条对肺炎链球菌具有高度特异性，与百日咳鲍特菌、脑膜炎奈瑟氏菌等其他重要呼吸道致病菌无交叉反应.室温保存12个月，其检测结果无明显变化.与现行检测方法相比较，该研究制备的试纸条具有操作简便、检测快速、检出限低、特异性强、稳定性好等优点，其灵敏度和特异性分别为70%,和100%.而且与国外同类产品(美国BinaxNOW®产品)相比，灵敏度具有较高的一致性，而且特异性可达到100%,，性价比更高，为肺炎链球菌感染疾病的临床检测与早期诊断提供了一个新的手段.
关键词：肺炎链球菌;免疫层析试纸条;单克隆抗体
肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)是社区获得性肺炎、脑膜炎、中耳炎和败血症等的主要病因之一，在流感病患者中，常继发肺炎链球菌感染[1].在急性呼吸系统感染中肺炎链球菌造成的死亡率大约有30%，显著高于病毒造成的死亡率[2].
目前，用于检测肺炎链球菌的方法很多，包括细菌培养法、酶联免疫法(ELISA)和核酸扩增技术(PCR)等[3–6]，其中细菌培养法仍是目前检测肺炎链球菌感染的“金标准”，但传统的肺炎链球菌培养方法灵敏度太低，耗时较长，至少需要2,d以上，血培养阳性率仅10%,左右[7];PCR技术虽然可以对肺炎链球菌准确检测，但是操作复杂，需要特殊引物、实验仪器设备和专业人员，不能适应快速检测的要求.
免疫层析技术以胶体金作为示踪标志物，基于抗原抗体反应原理具有检测速度快、灵敏度高、特异性强、操作简便等特点，已经在临床检验、动植物免疫、食品安全等各领域得到广泛应用[8–9].
细胞壁多糖抗原(C-polysaccharide，C-Ps)是细菌细胞壁的组成成分，为肺炎链球菌各血清型所共有.针对细胞壁多糖抗原制备的单克隆抗体，具有特异性强、灵敏度高、交叉反应小的优势[10].本试纸条通过检测尿液中的细胞壁多糖抗原，达到对肺炎链球菌性感染快速诊断的目的，是一种简便快速的诊断方法.
1材料与方法
1.1材料菌株：肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、肺炎克雷白菌(Klebsiellapneumoniae)、百日咳鲍特菌(Bordetellapertussis)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitides)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)、白色念珠菌(Moniliaalbican)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、血链球菌(Streptococcussanguis)，康希诺生物股份公司保藏.
尿样：含有10,ng/mLC-Ps的健康人群尿样的阳性尿样40份，健康人群阴性尿样40份.
试剂：弗氏不完全佐剂、PEG8000，Sigma公司;1640培养基、胎牛血清(FBS)，Gibco公司;氯金酸(AuCl3·HCl·4H2O)、柠檬酸三钠(C6H5Na3O7·2H2O)、三羟甲基氨基甲烷(C4H11NO3)，国药集团;牛血清白蛋白GHB034，杭州毕肯莱博生物科技有限公司;酶标羊抗小鼠、羊抗小鼠IgG，北京博奥龙免疫技术有限公司;肺炎链球菌细胞壁多糖标准品，美国SSI公司;对照试纸条为美国BinaxNOW®产品，美国英维利斯公司.
耗材：CN140硝酸纤维膜，赛多丽丝公司;GF-15金标垫、GF-60样品垫、AP270吸水纸、PVC底板、卡壳、铝箔袋，杭州毕肯莱博生物科技有限公司.
仪器：MK3酶标仪、311型CO2培养箱、加热磁力搅拌器，Thermo公司;HM3030划膜喷金仪、ZQ2002斩切机，上海金标生物科技有限公司;鼓风干燥箱，北京中科国仪科技有限公司.
1.2抗体的制备
分泌抗C-Ps单克隆抗体的细胞株5B3B9由本实验室保存.按照参考文献[11]中的方法并作改进.复苏细胞至对数期注射至经弗氏不完全佐剂致敏1周后的小鼠体内.收集腹水，离心取上清液，进行亲和纯化.
1.3胶体金及金标抗体的制备
按照参考文献[12]取0.01%,的氯金酸溶液100,mL在加热磁力搅拌器上加热至沸腾，加入1%,柠檬酸三钠水溶液1.2,mL，继续煮沸15,min，此时关闭加热功能继续搅拌，不再沸腾时停止搅拌.平衡至室温，恢复体积至100,mL.取胶体金100,mL，用0.2,mol/LK2CO3溶液调节至pH=8.5，将2,mg抗CPs单克隆抗体5B3B9加入胶体金溶液中，混匀后室温静置1,h，加入10%,BSA至质量分数为1%,，再加入10%,PEG8000至质量分数为0.2%,，混匀后室温静置1,h.7,000,r/min离心45,min，小心吸取上清液，用胶体金复溶液重悬沉淀至原标记体积的1/10.
1.4金标快速检测试纸条的组装
试纸条由吸水纸、硝酸纤维素样品垫和PVC底板组成.将抗C-Ps单克隆抗体5B3B9用10,mmol/LPB稀释成1,mg/mL，用划膜仪以1,µL/cm的上样量滑膜于硝酸纤维膜的检测线(T线)上，将羊抗鼠IgG用同样方法稀释成1,mg/mL，同样上样量滑膜于硝酸纤维膜的质控线(C线)上.37,℃温箱中干燥1,h后取出.最后将样品垫、金标结合垫、NC膜和吸水纸依次粘贴到PVC底板上，用斩切机切成4,mm宽的试纸条，装入检测卡中，加干燥剂密封于室温避光保存.
1.5检测及结果判定方法
将检测试纸条水平放置，取100,µL尿样滴加于加样孔，第15,min时判定结果，15,min后无效.结果判断方法如图1所示.
检测试纸条纤维素膜上出现2条红色线为肺炎链球菌阳性;仅出1条红色线(近吸水纸端)为阴性.如果质控线无显色条带，则视为试纸条失效.
1.6试纸条特异性实验
培养人体呼吸道、肠道等常见细菌至106～109,mL-1，将其裂解液作为待测样品，用同批次的试纸条按照检测及结果判定方法检测试纸条，分别对待测样品进行检测，并检测其重复性.
1.7试纸条最低检测限度实验
将C-Ps以生理盐水分别稀释至500、200、100、50、20、5、1、0,ng/mL制成待测样品，用同批次的试纸条按照检测及结果判定方法检测试纸条，对待测样品进行检测，并检测其重复性.
1.8试纸条稳定性实验
将试纸条密封存放于室温和37,℃，每隔1周取出，检测其阳性符合率、阴性符合率、特异性及灵敏度的变化.
1.9不同试纸条的比较
选取美国BinaxNOW®肺炎链球菌抗原检测试纸条进行对照检测.分别按照检测及结果判定方法对阳性样品及阴性样品进行检测，比对灵敏度及特异性.
2结果与分析
2.1抗C-Ps单克隆抗体评价
应用免疫双扩散法对抗C-Ps单克隆抗体进行评价.加入20,µL质量浓度为100,µg/mL的C-Ps标准品于中间孔中;分别加入20,µL质量浓度为100、50、25、12.5、6.25,µg/mL抗C-Ps单克隆抗体于1—5号孔中;加入20,µL生理盐水于6号孔中，作为阴性对照.结果如图2所示，抗体效价不低于6.25,µg/mL.图2抗C-Ps单克隆抗体免疫双扩实验结果Fig.2ResultsofdoubleimmunodiffusiontestforC-PsMab
2.2胶体金的质量鉴定
透射电镜下，制备的胶体金呈现球形，较均一、分散性较好(图3).紫外–可见分光光度计扫描表征结果如图4所示，其最高吸收峰在531,nm处，峰型较窄，与报道的40,nm胶体金的等离子共振吸收峰一致.
2.3试纸条检测结果
用试纸条分别检测阳性参考品、阴性参考品，其检测结果阳性明显清晰，阴性无假阳，阴阳性均能在15,min内显现，且检测结果可重复，如图5所示.
2.4试纸条特异性实验
将肺炎链球菌、肺炎克雷白菌、百日咳鲍特菌、脑膜炎奈瑟氏菌、流感嗜血杆菌、大肠埃希氏菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、血链球菌等菌株分别培养至106～109,mL-1，将菌体裂解后用制备的试纸条分别进行检测，同时设立阴性对照，结果见表1.仅有肺炎链球菌呈现阳性反应，而对其他菌和阴性对照皆呈阴性，且结果可重复.
2.5试纸条最低检测限度实验
用生理盐水将C-Ps分别稀释至500、200、100、50、20、5、1、0,ng/mL，分别用标记为1—8号试纸条进行检测，结果如图6所示.质量浓度为1,ng/mL样品结果仍呈阳性且0,ng/mL结果为阴性，结果可重复.
2.6试纸条稳定性实验
试纸条于37,℃条件下保存21,d，检测其阴阳性符合率、灵敏度和特异性，结果符合标准;室温条件下保持12个月的试纸条，检测上述指标结果符合标准.
2.7自制试纸条与国外同类产品的比较
用自制试纸条和BinaxNOW®试纸条对肺炎链球菌C-Ps阳性参考品和阴性参考品同时检验的结果是一致的.
配制肺炎链球菌C-Ps阳性尿样40份(50%)，阴性样本40份(50%)，分别使用自制试纸条和BinaxNOW®试纸条进行灵敏度检测，结果见表2.
由表2可知：自制胶体金免疫试纸条检测阳性28份(35.0%)，阴性52份(65.0%);BinaxNOW®试纸条检测阳性40份(50%)，阴性40份(50%).自制胶体金试纸条灵敏度70.0%，特异性100%，阳性预测值100%，阴性预测值76.9%.BinaxNOW®试纸条灵敏度100%，特异性100%.自制胶体金试纸条与BinaxNOW®试纸条检测结果一致率Pa值为85.0%,，在检测结果无关联的假定下，期望一致率Pe值为50.0%,，Kappa值为70.0%,.
胶体金免疫层析方法检测肺炎链球菌细胞壁多糖抗原相关论文推荐阅读：呼吸机如何护理肺炎
3结论
本文以胶体金为示踪物，采用肺炎链球菌细胞壁多糖单抗，成功研制了肺炎链球菌免疫层析试纸条.试纸条最低检测限达到1,ng/mL，与百日咳鲍特菌、脑膜炎奈瑟氏菌、流感嗜血杆菌、大肠埃希氏菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌等无交叉反应;试纸条37,℃保存21,d，或置于室温12个月，阴阳性符合率、特异性和灵敏度无变化，具有良好的稳定性;阳性结果对于快速诊断疾病，避免不必要的使用抗菌药物等都有极大的帮助.但是，抗原检测结果受很多因素的限制，包括灵敏度和特异性.本实验自制的胶体金试纸条灵敏度为70.0%,，特异性为100%,，与国外报道的胶体金试纸条灵敏度基本处于52%,～88%[13-14]的结果基本一致.该方法阳性预测值为100%,，阴性预测值为76.9%,，因此当该试剂盒检测为阳性时，基本可以确定为肺炎链球菌感染，而检测为阴性时则需要进一步确认.
与现有检测方法相比，本研究研制的试纸条具有简便、快速、准确的特点，兼有较特异性强、稳定性好、成本低的优点，可以在15,min内凭借肉眼判定结果，方便保存和运输，便于在社区医院和家庭中使用，而且作为辅助诊断主要工具，弥补了国产肺炎链球菌诊断试纸暂无市售的空缺，具有较高的市场潜力和应用前景.
转载请注明来自：http://www.lunwencheng.com/lunwen/yix/15832.html
