摘要:目的对北京市售鸽肉中大肠杆菌和沙门氏菌进行分离鉴定,并对分离菌株进行抗生素耐药性分析。方法使用缓冲蛋白胨水增菌液淋洗肉鸽样品后,使用大肠杆菌(E.coli,EC)增菌肉汤和丹麦国家血清研究院(StatensSerumInstitute,SSI)肠道细菌琼脂分离大肠杆菌,使用四硫磺酸盐(tetrasulfonate,TT)增菌肉汤和木糖赖氨酸脱氧胆盐(xyloselysinedeoxycholate,XLD)琼脂平板分离沙门氏菌,使用生化鉴定进行可疑菌确认。参照CLSI2016版推荐的肉汤稀释法,测定15种抗生素对所分离大肠杆菌和沙门氏菌的最低抑菌浓度(minimalinhibitoryconcentrations,MICs)。结果样品(n=200)中大肠杆菌(n=104)检出率为52.0%,沙门氏菌(n=41)检出率为21.0%。所分离的42株沙门氏菌菌株均对头孢他啶、氨曲南、厄他培南和替加环素敏感,对氨苄西林、萘啶酸、环丙沙星、四环素、复方新诺明和氯霉素的耐药率在30%以上,部分菌株对头孢噻肟(4.8%)和黏菌素(2.4%)耐药。所分离的104株大肠杆菌菌株均对替加环素敏感,对氨苄西林、头孢噻肟、氨曲南、萘啶酸、环丙沙星、四环素、复方新诺明、氯霉素和卡那霉素的耐药率在30%以上,部分菌株对头孢他啶(2.9%)、厄他培南和(1.0%)和黏菌素(9.6%)耐药。结论北京市售鸽肉是耐药大肠杆菌和沙门菌的重要储存库,相较于我国其他地区市售猪肉,鸡肉,牛肉等分离的耐药菌株,表现出不同的耐药谱,耐药率相对较低,但是北京市售鸽肉所携带的菌株已经累积了复杂的耐药特征,有必要对其中存在的耐药机制进行系统研究。
关键词:肉鸽;大肠杆菌;沙门氏菌;分离与鉴定;耐药性
1引言
肉鸽也叫乳鸽,是指4周龄内的幼鸽,由于其营养丰富、营养价值高,而深受人民群众的喜爱[1,2]。这些年来,随着农村产业结构的调整,养鸽业得到了较好的发展,由散养发展到目前的规模饲养,因而,随着饲养数量的增加和方式的改变,疾病的发生也比以前更为频繁和复杂[3,4]。为了促进肉鸽生长、预防及治疗感染,抗生素被广泛应用于肉鸽饲养过程中。抗生素的使用导致了多重耐药菌株的大量出现,更为严重的是多重耐药菌可能会通过食用动物传递给人类,沙门氏菌和大肠杆菌也逐渐成为我国公共卫生和食品安全领域最常见的食源性致病菌[5]。故应引起食品生产企业及政府监管部门的高度重视,并应不断深入开展主动监测和风险评估工作[6-11]。
北京市售鸽肉中大肠杆菌和沙门氏菌分离鉴定及耐药性分析相关期刊推荐：《食品安全导刊》(月刊)是由中国商业联合会、北京肉类食品协会主办的一本关注食品安全技术、知识的专业期刊。杂志围绕行业与领域、产业与市场、产品与技术，关注食品加工生产到流通销售产业链安全，建构食品安全领域技术、知识、信息的传播、交流平台。栏目设置：动态、特别报道、质量控制、检验检测、技术方案、体系、认证、政策等。
国内已有针对不同地区畜禽来源的耐药菌株研究,但主要针对猪、牛、鸡来源菌株[12],而对于鸽肉研究较少。本研究拟对北京市售鸽肉中大肠杆菌和沙门氏菌进行了分离鉴定及药敏试验研究,以了解当前北京鸽源致病性大肠杆菌和沙门氏菌的最新流行特点,为大肠杆菌和沙门氏菌病的预防、治疗、控制及净化提供理论依据[13]。
2材料与方法
2.1仪器和试剂
PL2002电子天平(美国梅特勒-托利多公司);MLS-3780高压灭菌器(日本三洋公司);Thermo1389生物安全柜、PR205050GCN生化培养箱(美国THERMO公司)。
BPW增菌液(北京君立康科技发展有限责任公司);TT增菌肉汤、TSB增菌肉汤、EC增菌肉汤、XLD培养基和SSI肠道细菌琼脂培养基(美国BD公司);TSA平板(北京奥博星生物技术有限责任公司);药敏检测板(上海星佰生物技术有限公司);API20E鉴定条(法国生物梅里埃股份有限公司)
质控菌株为大肠杆菌ATCC25922(美国模式培养物集存库)、大肠杆菌ATCC35218、肺炎克雷伯菌ATCC700603(美国模式培养物集存库)。
2.2样品来源
2016年8月,从北京市锦绣大地、岳各庄、新发地农副产品批发市场的13个摊位采集新鲜和冷冻鸽肉样品,并详细记录样品信息。将采集的鸽肉样品置于Stomacher500®匀浆袋中,样品采集后4h内进行大肠杆菌和沙门氏菌检测。
2.3实验方法
2.3.1细菌分离与鉴定
每只鸽肉样品加入缓冲蛋白胨水225mL,反复揉搓鸽胴体5min,36℃培养20~22h。
1)大肠杆菌的分离鉴定
取100µL缓冲蛋白胨水培养物接种于10mLEC增菌肉汤,在37℃静止培养20~22h。取一环培养物接种于丹麦国家血清研究院(StatensSerumInstitute,SSI)肠道细菌琼脂平板36℃培养22~24h。从每个平板上挑取1~2个典型可疑菌落,用API20E鉴定条进行确认[14,15]。将确认后的大肠杆菌保存于50%甘油-脑心浸液肉汤中,放置于-70℃冰箱中备用。
2)沙门氏菌的分离鉴定
取100µL缓冲蛋白胨水培养物接种10mL四硫磺酸盐(tetrasulfonate,TT)增菌肉汤,在42℃培养20~22h。取一环培养物接种于木糖赖氨酸脱氧胆盐(xyloselysinedeoxycholate,XLD)琼脂平板,36(±1)℃培养22~24h。从每个平板上挑取1~2个典型可疑菌落,用API20E鉴定条进行确认[16,17]。将确认后的沙门氏菌保存于50%甘油-脑心浸液肉汤中,置于-70℃冰箱中备用。
2.3.2细菌药敏测定
取分离得到大肠杆菌和沙门氏菌的二代新鲜培养物,使用棉签刮取培养物至无菌生理盐水中,涡旋混匀后,使菌悬液麦氏浊度达到0.5MCF。取50μL菌悬液加入10mL药敏检测肉汤中,涡旋混匀后加入药敏检测板。
参照CLSI2016版推荐的肉汤稀释法,测定所分离大肠杆菌和沙门氏菌对氨苄西林(1~128µg/mL)、头孢他啶(0.03~64µg/mL)、头孢噻肟(0.015~128µg/mL)、厄他培南(0.03~16µg/mL)、环丙沙星(0.015~512µg/mL)、氯霉素(1~128µg/mL)、庆大霉素(0.125~64µg/mL)、替加环素(0.015~32µg/mL)、四环素(0.25~64µg/mL)和复方新诺明(0.06/1.19~16/304µg/mL)、氨曲南(2~64µg/mL)、萘啶酸(8~64µg/mL)、黏菌素(0.5~32µg/mL)、卡那霉素(16~128µg/mL)、头孢西丁(2~64µg/mL)[18]。
3结果与分析
3.1细菌分离与鉴定结果
从北京市锦绣大地、岳各庄、新发地3个农副产品批发市场的13个摊位共计采集鸽肉样品200份,分别从不同数量样品中检出了104株大肠杆菌,检出率为52.0%;检出41株沙门氏菌,检出率为21.0%,其中从锦绣大地采集的样品中沙门氏菌的阳性率显著性高于岳各庄和新发地采集的样品(表1)。
3.2药敏分析
对所分离的42株沙门氏菌进行药敏分析,耐药率见表2,耐药谱见表3。对北京市锦绣大地、岳各庄、新发地3个农副产品批发市场的13个摊位共计采集鸽肉样品200份所分离的42株沙门氏菌进行药敏分析发现,所有菌株均对头孢他啶、氨曲南、厄他培南和替加环素敏感。所分离菌株对氨苄西林、萘啶酸、环丙沙星、四环素、复方新诺明和氯霉素的耐药率在30%以上,部分菌株对头孢噻肟(4.8%)和黏菌素(2.4%)耐药。对不同抗生素的耐药性进行分析发现,大量菌株呈现多重耐药。
对所分离的104株大肠杆菌进行药敏分析,耐药率见表2,耐药谱见表4。对北京市锦绣大地、岳各庄、新发地三个农副产品批发市场的13个摊位共计采集鸽肉样品200份所分离的104株大肠杆菌进行药敏分析发现,所有菌株均对替加环素敏感。所分离菌株对氨苄西林、头孢噻肟、氨曲南、萘啶酸、环丙沙星、四环素、复方新诺明、氯霉素和卡那霉素的耐药率在30%以上,部分菌株对头孢他啶(2.9%)、厄他培南和(1.0%)和黏菌素(9.6%)耐药。对不同抗生素的耐药性进行分析发现,大量菌株呈现多重耐药。
4结论
沙门氏菌和大肠杆菌是常见的人畜共患病原体,人常通过摄入被沙门氏菌和大肠杆菌污染的各类家畜产品、水果和蔬菜而感染,沙门氏菌和大肠杆菌是鸽子的常见病原体,可通过食物链传给人类,因此,研究肉鸽群体的沙门氏菌和大肠杆菌携带率和耐药性有助于预防食品沙门氏菌和大肠杆菌感染的发生[6]。
本研究结果显示,北京市售鸽肉中耐药大肠杆菌和沙门菌的感染率较高,相较于我国其他地区市售猪肉、鸡肉、牛肉等分离的耐药菌株,表现出不同的耐药谱,耐药率相对较低[5,12],但是北京市售鸽肉所携带的菌株已经累积了复杂的耐药特征,有必要对其中存在的耐药机制进行系统研究,从而为社区食品安全防控措施的制定提供有力的数据支持。
同时,为避免耐药性范围的扩大,应注意改善北京地区肉鸽养殖场的用药习惯,合理用药,针对性防治,并通过改善饲养环境,制定严格的消毒程序和免疫程序等措施来减少使用抗生素等易产生耐药性药物的使用。
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