【摘要】目的影像学动态监测裸鼠原位肝癌建模后肿瘤生长并与病理对照，判断干预治疗的合适时期。方法HepG2细胞注射裸鼠皮下，成瘤后切成1mm3组织块，植入15只裸鼠肝内。建模后第4、6、8周分别对5只裸鼠进行超声、磁共振成像(magneticresonanceimaging，MRI)检查，测量肿瘤长径，完毕麻醉处死裸鼠，解剖观察肝成瘤状况，测量肿瘤长径，标本送病理。结果裸鼠肝癌成瘤率80%，肿瘤均为单个，边界清晰。超声检出率75%，MRI检出率100%。4周时肿瘤平均长径4mm，6周时平均长径7mm，8周时平均长径11mm。Wilcoxon秩和检验，超声与解剖比较，P=0.0059，MRI与解剖比较，P=0.208。4、6周时监测，肝癌超声表现均匀低回声;T2WI表现为边界清晰、均匀一致高信号;病理表现瘤细胞致密、核大、异型性明显。8周时监测，超声表现为不均匀低回声;T2WI为形态不规则高信号，中心杂乱、分布不均;病理表现为肿瘤内部坏死。结论组织块建模裸鼠原位肝癌成瘤率高。影像学特征与病理表现相关。MRI是全程监测肿瘤生长的有效影像学方法。1mm3瘤块接种裸鼠肝，4～6周可能是进行干预治疗的最佳时期。
【关键词】裸鼠;肝;原位癌;模型;超声;磁共振成像
原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤，疗效差，死亡率高[1]。加强肝癌的防治研究，必要且迫切。建立一个合适的动物肝癌模型对于探索人类肝癌治疗新方法有重要价值。常用的肝癌模型有皮下肿瘤模型及原位肿瘤模型[2-3]。皮下肿瘤模型方法简便、可以直观肿瘤生长。而原位肿瘤模型体现了人原发瘤浸润的恶性行为和生长状态，更接近人肝癌的生物学行为[4-6]。目前肝原位癌模型使用日益增多，但肿瘤接种后，判断肿瘤生长状况，动态观察模型与病理的相关性，报道较少。故本研究使用瘤块接种裸鼠肝，形成原位肿瘤后，使用超声、MRI检查，并与大体解剖、病理对比，以了解影像学诊断在监测肿瘤生长中的价值，评估进行干预治疗的合适时期。
1材料和方法
1.1实验材料
1.1.1实验动物
BALB/c裸鼠17只，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[SCXK(沪)2017-0005]，鼠龄为5～6周，体重20～22g，均为雄性(雄裸鼠较雌裸鼠成瘤率高[7]，且避免激素依赖性干扰实验结果[8])，分笼饲养于南通大学动物实验中心SPF级动物房[SYXK(苏)2017-0046]，灭菌水和饲料供动物自由摄入。实验动物饲养及实验处理均严格遵循南通大学动物中心实验动物福利与伦理委员会相关指南要求(IACUC20170303-002)。研究过程中做到按实验动物使用的3R原则给予人道主义关怀。
1.1.2细胞株
人肝癌细胞株HepG2(南通市肿瘤医院中心实验室提供)。
1.2主要试剂与仪器
细胞培养基(DMEM)、BI血清、胰酶购自Hyclone公司;戊巴比妥钠购自Sigma公司。倒置显微镜购自日本Olympus公司;超声检查仪购自美国Philips公司;MRI检查仪购自德国Siemens公司。
1.3实验方法
1.3.1肝癌细胞复苏及培养
液氮罐中取出HepG2，37℃水浴解冻。细胞移至离心管，滴加10%DMEM培养基。离心600r/min7min。弃上清液，再加DMEM培养。待细胞长到密度约90%时，弃上清液，PBS两次、加胰酶2mL，消化3～5min，待细胞变成圆形，呈漂浮状态，再离心600r/min7min，弃上清，滴加DMEM。共培养两瓶，每瓶长满约1×107个细胞。
1.3.2裸鼠皮下肿瘤建模
收集已培养细胞，计数后调整浓度为每0.2mL里包含1×107个细胞。取裸鼠2只，每只裸鼠右背部皮下注射细胞悬浮液0.2mL。
1.3.3裸鼠原位肝癌建模
待皮下移植瘤长到直径约0.8cm时，进行原位肿瘤建模。建模在SPF屏障环境内进行。四位实验医师，分成两组，每组两人，同时进行，对15只裸鼠进行建模。无菌条件下分别切取2只裸鼠的皮下肿瘤，去除坏死组织后切成1mm3瘤块，麻醉裸鼠(戊巴比妥钠，腹腔注射70mg/kg)，以0.2%碘伏消毒裸鼠腹部，行右肋缘下斜切口，长约2cm，打开腹腔、暴露肝，以10mL注射器的针头与肝右叶成15o角刺入肝被膜，深度约0.6cm，无菌棉签压迫8s止血，取上述一块1mm3瘤组织，用5mL注射器针头经创口植入裸鼠肝右叶被膜下隧道内，立即采用α氰基丙烯酸酯快速医用胶(OB医用吻合胶)(广州白云医用胶有限公司，1mL/支，广东，中国)滴注隧道口，确保瘤块无溢出，创面无出血，逐层关腹。每只裸鼠平均手术时间5～7min。动物维持麻醉状态30～40min后清醒，送回笼中SPF条件饲养。
1.3.4影像学监测肿瘤生长
15只裸鼠建模后，于第4周随机选择5只裸鼠、第6周剩余10只中随机选择5只裸鼠、第8周最后剩余5只裸鼠分别进行影像学检查，每次影像检查后，处死裸鼠，不再送回屏障环境饲养。影像检查包括超声、MRI。超声采用临床用检查病人的美国飞利浦公司Philipsiu-22彩色多普勒超声诊断仪，探头频率12MHz。裸鼠麻醉(戊巴比妥钠70mg/kg)后上腹部扫查，观察肝声像图，仔细寻找肝内异常回声。MRI采用临床用检查病人的德国西门子公司SiemensEspree3.0TMRI，行常规平扫。裸鼠麻醉(戊巴比妥钠70mg/kg)后放置在动物专用特殊线圈内(图1)，进行T1WI、T2WI相检查，发现T2WI较T1WI更加清晰显示肿瘤，且扫查时间更短，故均以T2WI进行扫查。T2WI:TR3140ms、TE81ms、横轴位层厚6mm、层间距1mm。FOV:64mm×64mm，baseresolution:256。
1.3.5病理检查
超声、MRI检查结束后，过量戊巴比妥钠(腹腔注射100mg/kg)处死裸鼠，解剖尸体，查看肝，仔细寻找是否有肿瘤存在，明确肿瘤数目、形态、包膜、腹腔有无转移结节等。如有肿瘤，测量长径。后取肿瘤，4%甲醛浸泡，送病理。石蜡包埋、HE染色。
1.4统计学方法
建模后对裸鼠肝肿瘤进行影像学、解剖测量。15只裸鼠分成三个不同时期，每期5只。每只裸鼠影像、解剖分别进行一次准确测量。先运用超声、MRI测量肿瘤长径(肿瘤最长径的长度代替面积来代表肿瘤大小的一维测量法，或称单径测量法，可简化测量步骤、提高准确性、减少误差[9])。未见肿瘤显示，数据以“0”表示。然后，处死裸鼠，大体标本测量肿瘤长径，没有成瘤的，肝肿瘤数据以“0”表示。解剖测量与超声、MRI结果进行比较。计量资料，非正态分布，采用Wilcoxon秩和检验。以P<0.05为差异有显著性。
2结果
2.1建模过程
使用1mm3肿瘤组织块通过肝创面进入隧道后，立即滴注微量(约0.05mL)OB医用胶，迅速形成淡淡的薄膜，封闭隧道口，2～3s后胶体干燥。每只裸鼠的接种肿瘤的时间平均为6min。术中平均出血量0.2～0.3mL。通常鼠肝血供丰富，组织脆而易破，普通针眼易出血不止，种植的瘤块易脱落、异位[10]。OB胶透明、粘接强度大[11]，迅速粘固鼠肝创面、无需缝合肝被膜，节约实验时间。还可彻底止血、覆盖肿瘤组织、避免瘤块脱出[10]。
2.2建模成瘤率
采用瘤块接种15只裸鼠肝后，12只形成肿瘤，3只未成瘤。成瘤率80%。成瘤肝肿瘤均呈单发结节、边界清晰、包膜完整。至第8周，肝内未见转移、腹腔未见转移灶。
2.3影像学结果
2.3.1超声结果
超声检出率为75%(9/12)。建模后第4周进行超声检查，4例成瘤肝超声仅发现1例肿瘤，超声显示鼠肝见低回声，边界清，内部回声均匀(图2)。其余3只未见明显占位病变。6周时，鼠肝见边界清晰的低回声，圆形或椭圆形，内部回声均匀(图3)。8周时，鼠肝见形态欠规则低回声，内部回声不均匀，中心散在点状强回声、高回声(图4)。不同时期超声测量结果见表1。
2.3.2MRI结果
MRI检出率为100%(12/12)。肿瘤接种4周后MRI监测，T2WI显示正常裸鼠肝为均匀低信号，肿瘤为高信号，边界清晰，信号均匀(图2)。6周时，T2WI右肝异常高信号，边界清晰，其内信号均匀(图3)。8周时，T2WI示形态不规则的高信号，中心杂乱，分布不均，可见斑片状低信号(图4)。肿瘤压迫周围脏器组织。不同时期MRI测量结果见表1。
2.4病理结果
大体形态学观察:裸鼠解剖后，探查15只裸鼠肝，12只发现瘤结节，3只未发现结节。成瘤结节边界清晰，形态圆形、椭圆形或分叶状，包膜完整。肝内未见子灶、转移灶。腹腔及其他脏器未见转移灶，未见腹水。4周时肝癌结节平均长径4mm、6周时平均长径7mm、8周时平均长径11mm。见表1。HE染色:4周时，瘤结节与正常肝分界清晰(箭头示)。正常肝细胞清晰、排列整齐，无核分裂相，而肿瘤细胞排列成实性、片状、异型性明显，细胞核不规则，核仁易见，分裂相多见(图2)。6周时HE染色显示瘤细胞核大、排列致密、分布不均匀，未见坏死(图3)。8周时示瘤细胞排列不齐、稀疏、分布不均，中心坏死明显(图4)。
2.5统计学结果
超声检查第4周漏诊3例，测量结果以“0”表示，超声全程测量的15个数据呈非正态分布，故统计采用秩和检验，超声测量与解剖测量比较，P=0.0059。MRI未见漏诊，MRI测量与解剖测量比较，P=0.208，差异无显著性，表明MRI是全程监测肿瘤生长的有效影像方法。注:A、B、C、D分别为超声、T2WI、解剖、HE染色(×200)结果。图3建模后6周，影像学与大体测量及病理对比Note.A-D:Resultsofultrasound，T2WI，anatomicalmeasurement，andHEstaining(×200)，respectively.Figure3Imagingcalculation，grossmeasurement，andpathologicalcomparisonofatumorat6weeksaftermodelestablishment
3讨论
本研究显示:瘤块接种裸鼠肝，成瘤率80%，肿瘤均为单发结节、边界清晰、包膜完整。肝原位癌建模方法有:肝、脾(瘤细胞通过脾静脉、门静脉入肝)癌细胞注射接种法、瘤组织块肝接种法等[12]。后者与前两者比较，操作稍复杂，耗时多，但重复性好[10]，潜伏期短、成瘤快。有报道[13]瘤块接种肝2周后，形成0.5cm肿瘤。而使用肝癌细胞(2×106)接种肝2周后，瘤结节仅0.1cm。脾内癌细胞(2×106)注射4周后，肝内肿瘤也仅0.1cm。Rao等[13]一次使用2～3个1mm3的瘤块植入裸鼠肝，2周后建模成功，直径达0.5cm。我们接种4周后，肿瘤直径4mm。他们成瘤比我们的快而大，考虑是因为一次植入了更多瘤组织。我们实验中有3例未成瘤，可能原因是接种肿瘤时，瘤块离体时间过长(最长时间48min)，瘤块缺血、癌细胞活性下降所致。
肿瘤影像学结果显示:超声4周时发现1例肿瘤，漏诊3例，漏诊原因分析:鼠肝为中等回声，而肿瘤为稍低回声(图2～3)，肿瘤与正常肝回声差别低，不易区分。其次，肿瘤直径小，又受肝旁腹腔气体干扰，故易漏诊。本研究使用临床检查超声仪，探头频率12MHz，分辨率在mm级别。高分辨率小动物超声成像系统探头频率30～60MHz，分辨率达30μm[14]，可更清晰显示肝实质回声及更细微结构，更准确评价肿瘤接种效果。我们未来也可使用该种仪器，进行更精细的研究。
T2相MRI检查，肿瘤与正常肝组织信号强度差别明显。T2WI(Philips1.5T)显示，大鼠肝为低信号，原位肝癌结节呈高信号[9]。T2WI(Philips1.5T)裸鼠皮下肝癌模型为高信号，有轻微-中等强化[15]。我们研究发现，T2WI(Siemens3.0T临床用仪器)配以特殊线圈(图1)，裸鼠原位肝癌高信号(图2～3)，正常鼠肝低信号，差别大，对比度高，肿瘤检出率高，达100%。虽然7.0TMRI较3.0TMRI能够提供更高图像对比度和分辨率。但在更高的磁场强度扫查，受检者需要忍受更多的不适感，如更大分贝噪音干扰、头晕、眩晕、恶心、金属味感等[16]。本研究使用临床用MRI配以小动物线圈，获得足够图像分辨率;且MRI测量肿瘤长径与病理测量长径比较，差异无显著性。3.0T临床用MRI配以动物线圈是全程监测裸鼠肿瘤生长的有效影像方法。
通过动态影像学监测，发现鼠肝癌不断生长，影像表现也不断变化。瘤块接种后4～6周，肝癌超声表现为境界清晰的低回声占位，内部回声均匀，无钙化。同期MRI均匀高信号。病理显示，癌细胞致密、实性、片状、异型明显。8周时超声表现为实性不均质低回声，中心回声增高，分布不均。同期MRI内部信号杂乱，强弱不均。HE染色肝癌中心大片坏死。研究结果显示:不同时期肿瘤的影像表现可以准确反映不同时期肿瘤的病理变化。4～6周时，肝肿瘤生长旺盛，是开始对肿瘤干预处理、进行治疗的最佳时期。到第8周后，肿瘤中心有坏死，干预治疗选择时期可能太晚。
本研究局限性:影像学研究没有在第5、7周进行，主要原因是MRI价格昂贵、费时费力，只是在间断时期进行。其次，研究仅进行了超声、MRI的常规检查，没有运用造影剂对肿瘤的血供状况进行检查，以后可以使用对比剂对肿瘤微血管进行更详细研究。
总之，采用瘤块接种法，裸鼠原位肝癌成瘤率高。MRI是全程监测肿瘤生长的良好的影像学方法，影像学表现与病理存在相关性。1mm3的肿瘤组织块接种后4～6周，裸鼠肝原位癌肿瘤生长旺盛，是进行干预治疗的最佳时期。
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