[摘要]目的：观察核心蛋白聚糖(DCN)对体外培养人翼状胬肉成纤维细胞(HPF)增殖的影响，并对照观察丝裂霉素C(MMC)对HPF的影响，寻找辅助治疗和预防翼状胬肉复发的新途径。方法：(1)取患者的翼状胬肉体部组织，采用组织块贴壁培养法原代培养HPF。(2)用0.01、0.1、1、5、10mg/LDCN及MMC分别作用于体外培养的HPF，24h、48h、72h后观察2种药物对HPF形态的改变，2种药物不同浓度分别作用12h、24h、48h后MTr法比较2种药物的作用效果，不同浓度的DCN作用48h后免疫组织化学染色增殖细胞核抗原(PCNA)法检测细胞生长活性，流式细胞术测定细胞周期时相变化。结果：10mg/LDCN或1mg/LMMC在12h后均能显著抑制HPF的增殖(P<0.05)，呈剂量和时间依赖性。1～10ms/LDCN作用48h使Go/G期细胞百分比上升(P<0.05)，510mg/LDCN作用48h使G2/M期和s期百分比(G2/M%+s%)显著下降(P<0.05)，实验组和对照组均未检测到终末期凋亡细胞。1—10mg/LDCN能浓度依赖性地抑制细胞表达PCNA(P<0.05)。结论：核心蛋白聚糖能抑制HPF的增殖，阻滞细胞在DNA合成前期。
[关键词】翼状胬肉;成纤维细胞;核心蛋白聚糖;丝裂霉素
翼状胬肉是一种常见的多发的眼表疾病，组织学以成纤维细胞异常增殖、胶原大量合成、细胞外基质过度沉积为组织学特点。国内外诸多学者对其发病机制进行了深人的研究，但确切的发病机制目前尚未完全明了。目前明确其病因与太阳光紫外线(ultravioletrays，UVR)照射有关，通过与之相关的自由基使大分子失活。近10年来，通过分子遗传学技术，对翼状胬肉的发病机制研究收获颇多。药物能在分子水平抑制血管生成及细胞增殖，进而抑制翼状胬肉的生长是目前一个新的研究方向I4J。
转化生长因子13(transforminggrowthfactor13，TGF—p)在各种类型的纤维化疾病中的过度异常表达可能是引起组织纤维化的重要机制之一，被认为是目前最重要的致纤维化细胞因子之一。研究表明：在翼状胬肉的上皮细胞，血管内皮细胞及基底膜，成纤维细胞均有过量的TGF一13表达，体外培养的翼状胬肉成纤维细胞可被TGF一13促增殖。基于TGF一13在翼状胬肉的发生及反应进程中的重要作用，能特异性地抑制TGF一13生物学活性的物质成为本次研究的首选。而人核心蛋白聚糖(decorin，DCN)正是这样一种物质，它作为一种已知的天然内源性TGF—B阻断剂而具有抗纤维化效果。从上世纪9o年代初起，DCN在眼科领域也开展了相关研究，主要集中于角膜的研究L6】。目前，尚未对翼状胬肉进行相关的研究，本实验选择体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞(humanpterygiumfibroblasts，HPF)作为研究对象，探讨TGF—B抑制剂DCN对其增殖和凋亡的影响，并与传统药物丝裂霉素进行比较，为其用于翼状胬肉的治疗和术后预防复发提供前期实验资料。
材料和方法
1主要试剂
DCN(R&D)，丝裂霉素C(mitomycinC，MMC;华北制药公司)，小鼠抗人角蛋白及波形蛋白单克隆抗体(SantaCruz)，小鼠抗人增殖细胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen，PCNA)单克隆抗体(SantaCruz)，SABC免疫组化试剂盒(武汉博士德公司)，DAB显色试剂盒(武汉博士德公司)。
2标本来源
共收集本院15例初发期翼状胬肉患者的手术标本，其中男性9例，女性6例，年龄49—58岁。
3主要方法
3.1HPF的原代培养及传代培养利用组织块培养法采用含200mL/L小牛血清的DMEM培养基将细胞常规培养于温箱中。待原代贴壁培养生长至基本汇满培养瓶瓶底时用2.5g/L的胰酶消化，按1：2继续传代培养，取第3或第4代细胞用于实验。制备细胞爬片，SP法染色进行鉴定。
3.2DCN及MMC对HPF增殖的影响在传代至第3或4代的HPF(贴壁24h后)中加入DCN，并以MMC为对照，10mg/L培养24h、48h及72h后在相差显微镜下观察细胞分布及形态学变化。吸去上清，各孔加MTY20L，孵育4h，加120txLDMSO，振荡后用酶标仪测490nm处吸光度值(A)。实验组细胞抑制率(inhibitoryrate，IR)(%)=(阴性对照组平均A值一处理组平均A值)/阴性对照组平均A值×100%。
3.3流式细胞术检测DCN对细胞周期分布及凋亡情况待HPF传代至第3或第4代，取不同浓度的DCN(0.01、0.1、1、5、10mg/L)分别处理48h后的实验组及对照组(不加药)细胞悬液，每组各4瓶标本，PBS洗涤2次后离心，弃上清，加入70%冷乙醇，吹打成单细胞悬液后加入70%冷乙醇固定过夜，离心后弃上清，PBS洗涤2次，加入O.2mg/LRNA酶50mL，放人37℃恒温箱30min，碘化丙啶(PI)染色，4h内用FACS一420流式细胞仪(SD)检测，选用488nm激发波长测定样本。
3.4检测DCN对细胞表达PCNA的影响待HPF传代至第3或第4代，将细胞悬液接种于铺有盖玻片(按细胞培养用品清洗和高压灭菌)的6孔板中，孵育24h后分为A、B2组，A组为对照组，B组为DCN组(0.O1、0.1、1、5、10mg/L)，孵育48h后取出盖玻片，经免疫组织化学sP法染色(同前)检测PC—NA的表达。结果分析采用比较PCNA标记指数(1a—belingindex，LU，即平均每100个细胞中的阳性细胞数。计算6个视野(放大倍率20×10)的全部阳性细胞及阴性细胞并列表，将计数资料进行x检验。.
结果
1I-IPF免疫组织化学鉴定
体外培养的HPF经SP法染色可见波形蛋白表达阳性，位于胞浆，呈现与成纤维细胞长轴方向一致棕黄色束状或网状结构;细胞角蛋白表达阴性，见图1。
2ItPF生长曲线测定
对照组曲线可明显区分为指数增长期(接种后2—6d)和平台期(6d以后)，而用药组曲线下移，上升缓慢，趋于低平，无明显的指数增长期和平台期，在用药5—6d吸光度达峰值，以后逐渐下降，见图2。
3不同浓度DCN及MMC对I-IPF的增殖抑制作用
2组药物随浓度增加，其抑制作用增强，并呈剂量依赖性，dcn组不同尝试的抑制率均低于mmc组，尤其是当DCN药物尝试低时。
4统计学处理
采用SPSS13.0软件作统计处理，计量资料用均数±标准差(4-s)表示，组间差异性比较用单因素方差分析，细胞数量与吸光度值(A值)关系采用相关分析，以P依赖性，见表1~3。DCN组不同浓度的抑制率均低于MMC组，尤其是当DCN药物浓度低时，即lmg/L时，其抑制作用增强增快。MMC组：随时间的延长，细胞可出现毒性反应，可见细胞碎裂、崩解，有活性的细胞数逐渐减少。DCN组：药物作用后随时间的延长细胞数无明显减少，无细胞碎裂、崩解，活性细胞形态无明显改变，极少部分细胞贴壁性变差，形成团块状。
4流式细胞术检测不同浓度DCN对HPF细胞周期的影响
1~10mg/L.DCN使Gn/G，期细胞显著增多(P<0.05)，5~10mg/LDCN使S期细胞下降显著(P<0.05)，没有检测到终末期调亡细胞。增殖率G./M%+S%反映了细胞增殖能力，5~10mg/LDCN使G、/M%+S%显著下降(P<0.05)，表明细胞增殖能力下降，见表4。
5DCN对细胞PCNA表达的影响细胞阳性表达显示为棕黄色、黄色或浅黄色细小均匀颗粒，分布于整个细胞核;细胞核无着色、胞浆呈淡黄色者为阴性。1~10mg/LDCN组的阳性细胞数较对照组差异非常显著。PCNA标记指数随着药物浓度增加而递减，说明DCN对HPFPCNA的表达明显影响并具有浓度依赖性。
讨论
DCN作为TGF—p的天然抑制剂，具有抗纤维化及抑制细胞生长的两大特性，已被视为对器官纤维化及肿瘤具有良好治疗前景的药物。研究发现，DCN除了可干扰转化生长因子TGF—B与其受体的结合而中和其活性从而具有减轻组织纤维化的作用外，还可修饰胶原蛋白链而调节胶原的合成，与纤连蛋白(FN)和血小板反应蛋白一1(TSP一1)结合从而起到抗黏附、抑制细胞与FN和TSP一1基质结合、调节细胞的增生、转移和浸润的作用。DCN单独或与TSP一1结合能干扰细胞外基质(ECM)分子诱导的内皮细胞受体的激活，从而阻断细胞内转导通路引起的细胞骨架重构、迁移和管样结构的形成6j。另外，DCN还能与结缔组织生长因子(CTGF)结合J，CTGF也是致纤维化因子之一。
DCN抑制包括肿瘤细胞在内的细胞增殖，其机制可能是：(1)DCN能够与TGF—BI、Ⅱ、Ⅲ型受体竞争性结合TGF—S，DCN与TGF—B具有高亲和力，DCN结合TGF—B成为无活性的复合物。一定剂量的DCN能使TGF—p1、TGF—B和TGF—p3活性降低，阻断TGF—B、TGF—p：和TGF—p与相应的TGF—B受体结合。(2)DCN可以与表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)互相作用，使其磷酸化，从而引起丝裂原活化蛋白激酶(mitogen—activatedproteinkinases，MAPKs)的活化，导致细胞内钙离子动员和细胞周期素依赖性抑制物p21表达，最终导致细胞生长的抑制。p21是周期素依赖性蛋白激酶(CDK)强抑制因子，在不同组织来源的肿瘤细胞研究中也证实DCN抑制细胞生长是通过诱导p21表达。(3)上调细胞内的钙离子浓度，可能激活蛋白激酶C信号通路。DCN可以上调细胞内钙离子浓度，并可被EGFR的特异性阻断剂抑制，提示DCN与EGFR结合后通过上调细胞内钙离子浓度而激活蛋白激酶c信号途径j。(4)DCN还可能通过抑制肿瘤血管生成而发挥抗肿瘤作用。Grant等研究证实，野生型肿瘤细胞的分泌物刺激血管内皮细胞的黏附、迁移、分化及出芽过程，而DCN则可抑制这些过程;体内实验则表明，将表达DCN的肿瘤细胞种植于裸鼠体内，肿瘤的生长及血管的生成速度明显减慢，我们还证实DCN的此作用与其抑制肿瘤细胞VEGF的表达及分泌有关。
本实验通过对体外培养的HPF进行观察，发现第2～6代HPF细胞增殖旺盛，传至第7代时，表明细胞开始向其它细胞类型发生转变，为保证细胞活性的一致性，实验均采用第3—4代HPF，观察10mg/LDCN、MMC分别在24h、48h、72h对翼状胬肉成纤维细胞的影响发现，等浓度的2种药物比较，DCN对细胞形态的改变远远低于MMC。
用流式细胞术分析细胞周期，1～10mg/LDCN浓度Go/G1期的细胞比率增高(P<0.05)，5～10mg/LDCN使s期的细胞下降(P<0.05)，表明DCN可以延缓细胞由G期向S期的过渡，提示DCN可能影响细胞周期，使HPF多数停滞于DNA合成前期，表明DCN可能抑制、干扰DNA合成，使细胞的倍增时间延长。没有检测到终末期凋亡细胞的结果表明DCN对HPF细胞增殖的抑制可能是使得细胞停滞在DNA合成前期，而并不影响细胞凋亡。G，/M%+S%反映了细胞增殖能力，5～i0mg/LDCN使G/M%+s%显著下降(P<0.05)，表明细胞增殖能力下降。
PCNA是一种核内蛋白，是DNA复制时6聚合酶的辅助物，其出现与细胞增殖有明显关系，直接参与核内DNA的合成，主要表达在细胞增殖周期的s期，被认为是一种准确、简便、并且可直接了解细胞增殖状况的研究指标。通过免疫组化方法对PCNA表达的检测，揭示DCN可通过间接抑制DNA复制而达到其抗增殖作用。经DCN作用后，HPF中Pc—NA的表达下降，表明HPF增殖减慢，生长受到抑制，与MTr和流式细胞术结果一致。
目前通过基因克隆技术也已成功获得DCNll。。。从组织中提取天然DCN有广泛的来源和技术上的可行性。鉴于DCN明显抑制纤维化和强的抗肿瘤生长及转移活性，加之其由人体产生、不具免疫原性、取材广泛、可通过基因工程规模化生产等优点，DCN被视为对器官纤维化及肿瘤具有良好治疗前景的药物。尽管如此，但目前尚存许多问题还没有解决，如DCN对不同组织不同细胞，其作用不尽相同，浓度大小作用也不尽相同，国内外有关DCN文献报道其有效工作浓度基本上都是在mg/L水平，0.01mg/LDCN可刺激正常肝细胞及肝星形细胞的增殖;5一lOmg/LDCN则具有抑制细胞生长的作用。而小剂量的DCN对肝癌细胞系HuH7即有明显的抑制效果¨。因此只有不断探索，深入研究，才能对其应用前景得出肯定的结论。本文采用的是0.O1—10ms/L范围浓度，当DCN药物浓度低时，即<1ms/L，其抑制作用不明显，当浓度>1mg/L时，其抑制作用增强增快。
综上所述，本研究从不同角度证实DCN具有很强的抗增殖作用，且在一定药物终浓度范围内呈剂量依赖性，提示DCN有可能成为新型抗增殖药物，并具有广泛的来源和技术上的可行性。但尚须进一步研究和确认其抗增殖作用的机制。鉴于药物作用在体内外具有一定的差异，我们将进一步观察和研究DCN对动物活体眼的药效及毒性反应，以便确定有效治疗浓度和最佳给药途径，为治疗和预防翼状胬肉的复发寻找新方法。
核心蛋白聚糖对翼状胬肉成纤维细胞增殖的影响相关期刊推荐：《中国病理生理》是中国科学技术协会主管、中国病理生理学会主办、暨南大学承办的全国性综合性病理生理学高级学术刊物。杂志刊登有关病理生理学研究(包括实验研究和临床研究)方面的论著、专题综述、临床生理专题讲座、教学研究、科研仪器和药品评价介绍等，注重介绍疾病发病机制和临床病理生理学研究。
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