摘要背景：组织工程技术的出现可以从根本上解决组织、器官的修复与重建问题，其中种子细胞的选择和应用则成为当前研究的热难点，成纤维细胞是各组织工程研究的热门选择。目的：总结分析成纤维细胞的生物学特性、自身分化潜能以及对干细胞分化增殖的影响。方法：运用计算机检索中国期刊全文数据库(2015 至 2019 年)和 PubMed 数据库(2005 至 2019 年)中有关于成纤维细胞生物学特性以及多向分化潜能的相关文献，并进行系统的归纳、总结和分析，对成纤维“干性” 的研究新进展进行全面阐述。结果与结论：成纤维细胞代谢旺盛、增殖能力强，具有合成和分泌蛋白质的功能，在不同微环境中可分化为不同细胞，拥有与干细胞一样强大的多向分化潜能，因此常运用于转分化、细胞培养、损伤修复以及组织工程，其中促进干细胞增殖及诱导分化的作用尤为显著，今后应最大化利用成纤维细胞生物学优势与干细胞共培养，为组织工程学提供种子细胞，为临床中创伤的修复提供更佳思路。
关键词：成纤维细胞;生物学特性;干细胞;增殖分化;微环境
0 引言 Introduction
组织、器官的损伤或缺损及其修复重建，仍是现代医学中最难解决的问题之一。细胞分化过程的研究与应用一直以来都是组织重建医学的重点领域，其中热门之一就是具有多向分化且性能优异的间充质干细胞，而其获取过程在一定程度上存在着有创、昂贵等缺点，且分离的间充质干细胞体外扩增能力有限导致了细胞表型的改变，降低了部分细胞分化的准确性，故诱导细胞分化的方法和因素还有待进一步深入研究，如分化介质、分化环境、生物反应器等。这也要求了研究需要的细胞模型，至少可满足易处理、多能分化、高扩增能力的条件，且不容易改变其表型。因此，标准的成纤维细胞系逐渐成为学者们研究细胞分化过程中选择的细胞模型[1]。文章介绍成纤维细胞的来源、生物学特性及其对不同干细胞增殖分化的作用及机制，并展望其在组织修复重建中的优势及前景。
1 资料和方法 Data and methods
1.1 文献检索和筛选要求
1.1.1 检索数据库 CNKI和PubMed数据库。
1.1.2 检索词 以“成纤维细胞，干细胞，增殖分化，多向分化”为中文检索词;以“fibroblasts，biological characteristics ， stem cells ， proliferation and differentiation，microenvironment”为英文检索词。
检索词的逻辑组配：成纤维细胞AND分化OR多向分化，成纤维细胞AND干细胞AND增殖分化OR分化; fibroblasts AND differentiation OR multidirectional differentiation ， fibroblasts AND stell cell AND proliferation and differentiation OR differentiation。
检索的时间范围：CNKI(2015至2019年);PubMed (2005至2019年)。
1.2 文献筛选标准纳入标准：①具有原创性，且观点明确，论据可靠; ②内容相关度高。排除标准：①内容相关性差或重复;②逻辑不严谨或可信度差的文献。
1.3 质量评估及数据的提取 计算机初检得到65篇文献，经资料收集者互相评估纳入文献的有效性和适用性，通过阅读文题和摘要进行初步筛选;排除中英文文献重复性研究，以及内容不相关的文献，最后纳入48篇文献进行综述。
2 结果 Results
2.1 成纤维细胞的来源和特征 成纤维细胞也称为纤维母细胞，是疏松结缔组织中最常见的细胞，但通常致密结缔组织中成纤维细胞的数量要多于同等体积疏松结缔组织中成纤维细胞的数量，故分离培养成纤维细胞主要以真皮等致密结缔组织为取材部位[2]。成纤维细胞在机体内分布广、数量多，其细胞体积大且形态多样多变，以梭形、鹿角形或星形为主，还能随不同的条件随时改变，细胞核比较大，为椭圆形，核仁明显;胞质嗜弱碱性，含有丰富而发达的粗面内质网、高尔基复合体以及游离核糖体，所以它具有强大的合成分泌蛋白质的功能。由于成纤维细胞起源于胚胎中胚层的间充质，故细胞增殖能力强且代谢旺盛，可体外培养、多次传代，还具备合成胶原纤维蛋白、粘连蛋白以及分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维的能力。当成纤维细胞成熟时或者处于静止状态，其胞体体积减小，呈长梭形，粗面内质网和高尔基复合体减少，被称为纤维细胞。在外伤等因素刺激下，部分纤维细胞重新转回幼稚的成纤维细胞，其分泌及合成功能活性随之恢复，从而参与组织损伤后的修复[3]，见图1。在结缔组织中，有少量具有分化潜能的间充质细胞也能在创伤修复等情况下增殖分化为成纤维细胞[4]。成纤维细胞只是从形态上被定义的一类细胞，目前仍然缺乏公认的标准来定义成纤维细胞，还有学者直接将成纤维细胞列入干细胞行列[5]。
2.2 成纤维细胞的多向分化性能
2.2.1 成纤维细胞诱导分化为诱导性多能干细胞 (induced pluripotent stem cells，iPSCs) 2006年，由日本Takahashi团队将4种转录因子(Oct3/4、Sox2、 c-Myc和Klf4)导入小鼠成纤维细胞，通过重编程获得了诱导性多能干细胞——一种和胚胎干细胞相媲美的全能干细胞[6]。随后，美国和日本2个研究组又分别采用不同的转录因子将人皮肤成纤维细胞转化为诱导性多能干细胞，可向3个胚层的所有细胞分化[7-8]，包括成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、肌和肌腱细胞、内皮细胞、许旺细胞[9]、肝细胞、神经细胞、心肌细胞等多种细胞[10]。
2.2.2 成纤维细胞分化为软骨细胞或成骨细胞 成纤维细胞虽与成骨细胞来源相同，却具有成骨细胞不具备的增殖特性，在一定的诱导条件下成纤维细胞还可向成骨细胞和破骨细胞分化，表达成骨标志物。例如，牙周韧带成纤维细胞能在不同类型生物力学刺激下作出胞内信号的应答，对其自身向成骨方向分化起到调控作用[11]。研究发现，在人牙周膜成纤维细胞和人微血管内皮细胞体外共培养模型中有早期成骨分化基因Twist-1、 Twist-2、tafazzin-5和msh homebox 2等的表达，为该共培养体系中成骨细胞分化的发生提供了证据[12]。重组骨形态发生蛋白9可通过碱性磷酸酶活性、Runt相关转录因子2/核心结合因子1表达增加从而诱导人牙周韧带成纤维细胞的成骨分化[13]。有明确报道，骨形态发生蛋白7可通过Smad和MAPK通路增强人真皮成纤维细胞的成骨分化作用[14]，小鼠皮肤成纤维细胞在c-Myc、Klf4 及SOX9基因的诱导下可高效地向软骨分化[15]。此外，已有报道指出人成纤维细胞在RNUX2、OSX、OCN、 BSP和Col1a基因的诱导下，能表达成骨标志物，并可诱导为功能完善的成骨细胞，目前已利用确定的转录因子如Osterix、Runx2、Oct4、L-myc成功将成纤维细胞直接转化为成骨细胞[16]。SOMMAR等[17]在体外通过组织工程技术构建的仿生3D培养模型中，皮肤成纤维细胞均可向成骨及成软骨分化。因此，成纤维细胞具有应用于骨缺损及其相关疾病治疗的巨大潜力。
2.2.3 成纤维细胞分化为肌细胞 有学者研究发现，纳米银能诱导成纤维细胞向肌纤维母细胞分化，以促进皮肤伤口肉芽组织的收缩、加速伤口的愈合[18];凝集素也能诱导成纤维细胞向肌纤维细胞分化同时分泌细胞外基质促进伤口愈合[19]，而且当提供一定生物力学刺激的情况下，成肌腱纤维如成熟肌腱组织一样，排列更为整齐紧密以抵抗外部机械拉力[20]。经修饰的肌纤维细胞分化蛋白mRNA转染人成纤维细胞，也是一种高效直接的诱导方法，最终使成纤维细胞向肌细胞方向分化[21]。此外，在肌腱水化胶细胞培养基条件下对比成纤维细胞和脂肪干细胞，发现成纤维细胞生存时间更长，适用于修复慢性肌腱损伤[22]。
2.2.4 成纤维细胞分化为脂肪细胞 起源于中胚层间质的成纤维细胞与脂肪干细胞表达一些相同的标志物 CD29、CD44、CD71d、CD73等，且在一定诱导条件下能分化为脂肪组织，例如有研究发现具有骨相关毒性的药物罗格列酮可诱导小鼠胚胎成纤维细胞成脂分化[23]，并且成纤维细胞生长因子亦能加强脂肪干细胞的脂向分化性能[24]，可见成纤维细胞对皮下脂肪组织也有促进生长的作用，但也从一定程度上参与了一些疾病发生发展的病理转化。
2.2.5 成纤维细胞分化为神经干细胞及神经元 研究表明，由于NEUROD2基因促进表达的miR-9/9*和 miR-124(miR-9/9*-124)产生诱导作用，人成纤维细胞在有神经干细胞分化生长相关基因转染条件下，可直接诱导分化为成熟的神经元[25]。另外还有学者发现，DNA双氧酶Tet3可通过介导DNA去甲基化，快速地诱导成纤维细胞成为功能神经元，表达成熟的神经元标志物[26]。相关研究结论也证明成纤维细胞因子具有较强的促进神经干细胞增殖和分化的作用，是重要的神经促生长因子，其促进细胞增殖和分化的作用呈浓度依赖型。但与其他类型干细胞比较，成纤维细胞向神经细胞的分化有着途径复杂、诱导率低的特点，仍需进一步深入探究。
2.3 共培养中成纤维细胞对干细胞增殖分化的影响及作用
2.3.1 成纤维细胞与胚胎干细胞共培养 有学者发现，牙周韧带成纤维细胞通过分泌成纤维细胞因子参与 MAPKs介导的信号通路调控胚胎干细胞的增殖和成骨分化[27]，除了成纤维细胞因子4、成纤维细胞因子7以外，牙周韧带成纤维细胞亦能产生转化生长因子、骨形态发生蛋白和一些其他细胞因子共同形成微环境从而加强其调控作用。还有研究证实，牙周韧带成纤维细胞诱导胚胎干细胞的增殖和分化是通过JNK和/或 ERK信号通路(MAPKs的亚分类)激活介导的[28]。因此，牙周韧带成纤维细胞对胚胎干细胞的增殖分化有重要的调控作用。
2.3.2 成纤维细胞与牙髓干细胞共培养 研究发现，在无外源动物血清的条件下加入血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子，小鼠成纤维细胞来源的诱导性多能干细胞可向血管内皮细胞定向分化，将分化后的细胞与牙髓干细胞共培养，内皮样细胞有形成血管的倾向[29]。另外，有研究人员成功构建了可注射的纳米纤维微球[30]，其具有良好的组织相容性，在与牙髓干细胞共培养时可提供良好的基质微环境，其中起到主要作用的是纤维微球分泌的成纤维细胞因子2，有效促进其成牙向分化，为最终达到牙本质修复目的奠定细胞基础。
2.3.3 成纤维细胞与间充质干细胞共培养 在共培养成纤维细胞以及由转化生长因子β1、血小板衍生生长因子BB和骨形态发生蛋白4组成的生长因子混合物的条件下，间充质干细胞可自主向血管平滑肌细胞分化，其中标记基因的转录增加，收缩装置蛋白的表达上调，并且血管平滑肌细胞表型的功能活性增强[31]。这项研究验证了成纤维细胞及细胞外基质提供的微环境具有直接将间充质干细胞诱导分化为成熟的、具有功能的血管平滑肌表型的能力，类似于可溶性生长因子的性能;而间充质干细胞本身就具有多项分化潜能，故在共培养体系中微环境的诱导及调控就显得极为重要。
(1)成纤维细胞对骨髓间充质干细胞的影响：研究发现，通过特定成纤维细胞生长因子预处理的骨髓间充质干细胞产生细胞外钙结节的数量、细胞内脂滴的数量、细胞酸性黏多糖的表达明显增加，且有成纤维细胞生长因子的微环境可以维持多次传代骨髓间充质干细胞的干细胞特性[32]。还有类似相关研究表明，碱性成纤维细胞生长因子转染的骨髓间充质干细胞与韧带成纤维细胞通过3D共培养，一方面促进了韧带成纤维细胞增殖的同时抑制了其胶原合成能力，另一方面促进骨髓间充质干细胞增殖的同时增强了其向韧带成纤维细胞分化的能力[33]。还有研究证明，加载有碱性成纤维细胞生长因子的壳聚糖能够将成年大鼠骨髓间充质干细胞高比例诱导分化为神经元样细胞[34]，为骨髓间充质干细胞自体移植治疗神经退行性疾病和中枢神经系统疾病提供了一定的理论和实验依据。
(2)成纤维细胞对脂肪间充质干细胞的影响：在与正常人类成纤维细胞共培养条件下，脂肪间充质干细胞的 MMP1、MMP2基因表达升高，TIMP1、TIMP2蛋白表达升高，故当受外部辐射时细胞增殖受损程度与对照组相比大幅减少[35]。还有研究提示，碱性成纤维细胞生长因子可促进透明质酸钠支架中的人脂肪干细胞向血管内皮迁移、分化，这意味着在人脂肪干细胞-透明质酸钠复合物中加入碱性成纤维细胞生长因子可加速移植物血运重建而减缓移植物的吸收，更好地构建组织工程脂肪，从而达到较为理想的修复重建效果[36]。
2.3.4 成纤维细胞对神经干细胞的影响 成纤维细胞分泌的碱性成纤维细胞生长因子具有强大的促神经干细胞增殖作用，又能增强中枢神经系统不同区域的神经元前体细胞的再生能力，并且具有浓度依赖性[37]，而反向来说，碱性成纤维细胞生长因子亦有助于诱导表皮干细胞向神经细胞分化，而且该诱导作用具有一定的细胞密度依赖性。故在不等同的微环境条件下，细胞间相互作用不尽相同，甚至完全相反。成纤维细胞对于神经干细胞的作用机制复杂且灵活，具有多样性。
3 成纤维细胞的优势、争议及展望 Advantages, controversies and prospects of fibroblasts
干细胞备受关注及开发的最主要标志即多潜能分化能力，而验证干细胞该重要性能的金标准需要进行体内实验，但目前大多文献报道的是体外实验，包括间充质干细胞和成纤维细胞各自优势、缺陷、争议，对二者的研究及对比研究也是目前组织工程种子细胞研究的热点。一部分学者认为，间充质干细胞大多分布于骨髓、脐血中，而在外周血中含量极少，提取受限，且具有免疫抑制[38];与此相比，成纤维细胞存在于机体各个组织，获取方便、快捷，可自体移植，能向3个胚层方向分化[39]。成纤维细胞保留了中胚层细胞增殖能力强的特性，多次传代后可不经过诱导性多能干细胞状态直接分化为另一种成熟细胞，通过重新编程实现跨胚层分化[40]，而且成纤维细胞成瘤风险小，可用于体内移植、药物筛选等，具有较间充质干细胞更优越的生物学特性。从细胞表面标志物来看，成纤维细胞可表达间充质干细胞标志物 CD105、CD73、CD90(阳性表达率≥95%)，而且间充质干细胞也能表达成纤维细胞标志物FSP-1、collagen Ⅰ、fibronectin和vimentin[41-42]，说明成纤维细胞和间充质干细胞很可能是同一类细胞，按照国际细胞治疗协会对间充质干细胞的定义，成纤维细胞符合其细胞标志物标准，因此一部分学者认为成纤维细胞可以作为间充质干细胞中的一类[43]。
有学者提出，成纤维细胞本身不具备多向分化性，以皮肤成纤维细胞举例，其拥有的“干性”可能是源于取材分离过程中残留的毛囊干细胞或者是存在于真皮中的少量间充质干细胞，因此才使得皮肤成纤维细胞从表面上看具备了多向分化潜能[43]。此外，BI等[44]实验验证不是全部的成纤维细胞都能向3个胚层方向分化，其中只有少量的成纤维细胞是多向分化潜能细胞，整个细胞群仍然具有较强的异质性，且大多数实验并未验证分化后的细胞是否具备相应的细胞功能，尽管成纤维细胞在创伤应激情况下可替代或补充干细胞的功能，但其又不能等同于完全意义上的干细胞，当补充功能发生调控异常，便形成纤维瘤、纤维肉瘤等。成纤维细胞的诱导转化还存在着效率不稳、机制复杂、信号不完全明确、构建组织不尽成熟等缺点，经直接重编程诱导分化的细胞与天然组织中该细胞成分的对比研究还相对较少[18]。因此，一部分学者认为相对于多向潜能天生优越的间充质干细胞，成纤维细胞的干性特征由其异质性决定，不能完全定义其为间充质干细胞。
这些局限性是目前研究的制约，同时也是今后深入研究的方向，说明成纤维细胞具有巨大的研究潜质。对于近年许多新技术的发展，如3D打印[45]、静电纺丝[46]、纳米材料及技术[47-48]，也能为成纤维细胞的研究和应用提供新的路径。成纤维细胞在以后的研究中可为组织工程学提供种子细胞，并由基础向临床应用转化过渡，为临床中创伤的修复、伤口的愈合、组织的重建提供新思路。——论文作者：杨桂然，王福科，李彦林
成纤维细胞的生物学特性及分化潜能相关期刊推荐：《中国组织工程研究》杂志，于1997年经国家新闻出版总署批准正式创刊，CN:21-1581/R，本刊在国内外有广泛的覆盖面，题材新颖，信息量大、时效性强的特点，其中主要栏目有：硬组织工程及植入物研究 、组织工程实验造模、方法及技术研究等。
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