摘要目的:分析R-ISS分期联合“多重打击”对多发性骨髓瘤(MM)患者的预后判断价值及不同“多重打击”组合对患者预后的影响。方法:选取并回顾性分析2013年4月至2019年10月新疆维吾尔自治区人民医院血液科收治的初诊MM患者220例，所有患者均经过FISH检测。比较R-ISS分期联合“多重打击”以及不同“多重打击”组合对预后的影响。结果:R-ISSII和III期中，“多重打击”患者的中位无进展生存(PFS)时间、总生存(OS)时间和持续缓解(DOR)时间均短于无高危细胞遗传学异常(HRCA)和仅包含一种HRCA的患者(P<0.05)，而TTR(达到反应时间)明显延长(P<0.05)。不同“多重打击”组合中，1q21+合并del(17p)、1q21+合并t(14;16)及1q21+合并t(4;14)3种“双打击”组合之间，1q21+合并del(17p)患者的预后最差。结论:不同“多重打击”组合的患者预后不同。R-ISS分期与“多重打击”相结合更有利于精准判断MM患者预后。
关键词多发性骨髓瘤;多重打击;R-ISS分期;预后
多发性骨髓瘤(multiplemyeloma，MM)是一种恶性克隆性浆细胞疾病。近年来，新型靶向药物和造血干细胞移植的广泛应用，使MM患者的生存得到了显著改善，但大多数患者仍然会复发[1]。随着对MM发病机制认识的逐步加深，遗传学异常被认为是MM患者危险度分层的基础[2-3]。目前，临床上常用的是R-ISS分期系统[4]，该分期系统将del(17p)、t(4;14)和t(14;16)这3种高危细胞遗传学异常(high-riskcytogeneticabnormality，HRCA)纳入其中。有研究表明，在高危MM患者中，多种危险因素共存者预后更差[5-6]。近年来，研究者参照多重打击淋巴瘤的概念，在MM中也引入了“多重打击”的概念[7]。2018年，Mayo更新了mSMART3.0分层，定义HRCA为t(4;14)、t(14;16)、t(14;20)、del(17p)、TP53突变、1q21+，具备上述任何2种或3种HRCA为“双/三打击”，即多重打击。目前，国内已有文献报道“多重打击”的发生率及其预后价值[8]，但R-ISS分期联合“多重打击”、以及不同“多重打击”组合对患者预后的影响仍需要进一步分析探讨。
材料和方法
入组患者
收集2013年4月至2019年10月新疆维吾尔自治区人民医院血液病科收治的初发MM患者220例的临床信息，包括年龄、性别、血清学结果、骨髓浆细胞计数、有无溶骨性病变及髓外浸润、FISH、DS分期、ISS分期、R-ISS分期等。所有病例均参照《中国多发性骨髓瘤诊治指南(2017年修订)》[9]进行诊断。分期参考1975年的Durie-Salmon(DS)分期[10]以及2005年国际骨髓瘤工作组(InternationalMyelomaWorkingGroup，IMWG)制定的ISS分期系统[11]和2015年的RISS分期系统[4]。
细胞遗传学异常的FISH检测
抽取肝素抗凝骨髓标本3-5ml，离心后应用CD138免疫磁珠分选富集所有患者的骨髓浆细胞。并严格按照FISH技术探针试剂盒(探针检测位点包括1q21、13q14、13q14/13q34、14q32、14q32/4p16、14q32/6p21、11q13/14q32、14q32/16q23、14q32/20q12、17p13.1/17p11.1-q11.1)说明书步骤操作，经固定、探针变性杂交后，中性树脂封片。观察400个分裂间期细胞荧光杂交信号，进行图像分析。
TP53基因突变的二代测序检测
采用CD138磁珠分选骨髓单个核细胞，用DNA提取试剂盒提取其基因组DNA。扩增TP53基因4-11号外显子，反应条件:94℃预变性3min，然后94℃30s，59℃30s，72℃90s(35个循环)，最后72℃延伸10min。PCR产物行Sanger测序。
判断依据
根据2018年MayomSMART3.0分层，定义多重打击。有国内外文献[12-13]提示，定义HRCA的FISH阳性阈值如下:t(4;14)=7.3%、t(14;16)=7.0%、del(17p)=20.0%、1q21+=6.0%。定义TP53突变双等位基因失活有意义。比较“多重打击”与不包含HRCA、仅包含一种HRCAMM患者的临床、预后特征，以及R-ISS分期联合“多重打击”、不同“多重打击”组合对预后的影响。相关文献研究指出，t(14;20)发生率低、检出率≤1%[14]，且本研究220例MM患者中均未检出，故该HRCA未纳入研究。其他CA包括del(13q)/13q14和t(6;14)、t(11;14)。
治疗方案
所有患者均接受以硼替佐米为基础的诱导化疗方案。包括硼替佐米+地塞米松(VD)、硼替佐米+环磷酰胺+地塞米松(PCD)、硼替佐米+多柔比星+地塞米松(PAD)。诱导治疗后根据化疗疗效以及患者自身意愿决定是否进一步行自体干细胞移植，其中接受自体干细胞移植的患者有36例(16.4%)。每3个疗程化疗后参照2016年IMWG更新的疗效评价标准[15]进行疗效评估，无HRCA组总疗程数不足3个的患者有4例，仅包含一种HRCA组总疗程数不足3个的患者有1例。
随访
通过查阅病例资料及电话方式收集资料及随访。所有患者均随访至2019年12月。定义无进展生存时间(PFS)为疾病确诊开始至疾病出现进展或末次随访结束时间。定义总生存时间(OS)为疾病确诊至发生死亡或末次随访结束时间。定义达到反应时间(TTR)为疾病确诊至第一次达到缓解时间。定义持续缓解时间(DOR)为第一次评估病情达到完全缓解或部分缓解至第一次疾病进展时间。
统计学分析
采用SPSS19.0软件进行统计学分析。组间构成比、率的比较采用χ2检验;统计结果符合正态分布数据用均数±标准差表示，组间比较使用t检验;不符合正态分布的数据用中位数(最小值-最大值)表示，组间比较使用秩和检验;生存分析采用KaplanMeier法。P<0.05为差异有统计学意义。
结果
患者的临床特征
本研究共纳入220例初诊MM患者，其中男134例(60.9%)，女86例(39.1%)，男∶女=1.56∶1;中位年龄61(41-84)岁;单克隆蛋白分型:IgG型112例(50.9%)、IgA型52例(23.6%)、IgD型10例(4.5%)、轻链型46例(20.9%)。初诊时各项指标:血红蛋白86.5(42.0-184.0)g/L，血肌酐83.9(33.0-1274.0)μmol/L，血钙2.24(1.54-4.23)mmol/L，白蛋白34.8(17.7-49.3)g/L，β2微球蛋白5.7(1.6-92.0)mg/L，LDH189.5(87.4-980.2)IU/L，骨髓浆细胞比例28.7%(3.5%-94.0%)。
遗传学异常(CA)的分布
220例初诊MM患者均进行FISH检测，CA分布结果见表1。无HRCAMM患者共108例(49.1%)，仅包含一种HRCAMM患者共65例(29.5%)，“多重打击”MM患者共47例(21.4%)，包括“双打击”患者41例(18.6%)，“三打击”患者6例(2.7%)。“双打击”患者中，del(17p)合并t(4;14)者1例，1q21+合并TP53突变者1例，1q21+合并del(17p)者10例，1q21+合并t(14;16)者14例，1q21+合并t(4;14)者15例。“三打击”患者中del(17p)合并t(4;14)、t(14;16)者1例，del(17p)合并1q21+、t(14;16)者1例，del(17p)合并1q21+、t(4;14)者4例。
无HRCA组、仅包含一种HRCA组及“多重打击”
MM患者的临床特征比较220例初诊MM患者中，无HRCA的MM患者108例，仅包含一种HRCA的MM患者65例，“多重打击”MM患者47例。组间比较:3组患者在不同RISS分期的比率差异均有统计学意义(P<0.05)，“多重打击”组R-ISSIII期患者比率高于仅包含一种HRCA组和无HRCA组的患者(59.6%vs26.2%vs6.5%，χ2=51.468)(P=0.000)。且初诊时贫血(Hb<100g/L)、骨髓浆细胞比例≥10%、高钙血症(Ca2+>2.75mmol/L)、伴有髓外病变的发生率在“多重打击”组的患者中最高，无HRCA组患者最低[χ2=17.816(P=0.000);χ2=18.311(P=0.000);χ2=6.531(P=0.038);χ2=37.001(P=0.000)]。其他特征，如年龄、DSII期、ISSII期、低蛋白血症、肾功能损害及溶骨性病变的发生率，3组之间差异均无统计学意义(P>0.05)(表2)。
无HRCA组、仅包含一种HRCA组及“多重打击”MM患者疗效的比较108例无HRCA的MM患者、65例仅包含一种HRCA的MM患者和47例“多重打击”的MM患者均接受以硼替佐米为主的治疗方案，分析3组间3个疗程治疗后的临床疗效，结果显示，3组患者在严格意义上的完全缓解(sCR)发生率差异无统计学意义(P>0.05)，而在完全缓解(CR)率、深度缓解率(≥VGPR)以及总体反应率(ORR)差异均有统计学意义(表2)。两两比较，结果显示，无HRCA组和“多重打击”组、仅包含一种HRCA组和“多重打击”组患者在CR率(P=0.000，P=0.001)、≥VGPR率(P=0.000，P=0.003)和ORR(P=0.000，P=0.003)的差异均有统计学差异;而无HRCA组和仅包含一种HRCA组患者在CR率(P=0.945)、≥VGPR率(P=0.186)和ORR(P=0.958)的差异均无统计学意义。由此可见，“多重打击”组患者的临床疗效(CR率、≥VGPR率以及ORR)明显差于无HRCA组、仅包含一种HRCA组的患者。
R-ISS分期联合“多重打击”对患者预后的影响
220例初诊MM患者中，R-ISSII期患者143例，RISSIII期患者52例，R-ISSI期患者25例(未携带任何HRCA，故未纳入分析)。中位随访时间为23.5(2.0-68.0)个月。生存分析结果显示，R-ISSII期患者中，无HRCA组、仅包含一种HRCA组及“多重打击”的MM患者中位PFS时间分别为38.0、27.0和20.0个月，中位OS时间分别为42.0、28.0和25.0个月，3组患者PFS率(P=0.000)和OS率(P=0.000)差异均有统计学意义(图1A、B)。3组间中位TTR分别为3.0、4.0和5.0个月，DOR分别为20.0、16.0和8.0个月，差异均有统计学意义(均P<0.05)(表3)。进一步组间比较，结果显示，无HRCA组和仅包含一种HRCA组、无HRCA组和“多重打击”组以及仅包含一种HRCA组和“多重打击”组患者的PFS率(P=0.048，P=0.000，P=0.000)、OS率(P=0.002，P=0.000，P=0.049)、TTR(P=0.026，P=0.004，P=0.001)和DOR(P=0.045，P=0.011，P=0.042)差异均有统计学意义。“多重打击”组患者的中位PFS、OS和DOR最短，仅包含一种HRCA组次之，无HRCA组最长;而“多重打击”组的中位TTR最长，其次为仅包含一种HRCA组，无HRCA组最短。R-ISSIII期患者中，无HRCA组、仅包含一种HRCA组及“多重打击”MM患者的中位PFS时间分别为26.0、18.0和12.0个月，中位OS时间分别为29.0、22.0和16.0个月，3组患者PFS率(P=0.000)和OS率(P=0.002)差异均有统计学意义(图1C、D);“多重打击”组中位TTR时间最长，DOR时间最短，不同组患者TTR和DOR差异有统计学意义(P<0.05)(表3)。进一步组间两两比较后结果显示，无HRCA组和“多重打击”组、仅包含一种HRCA组和“多重打击”组患者的PFS率(P=0.001，P=0.002)、OS率(P=0.004，P=0.030)以及TTR(P=0.032，P=0.003)、DOR(P=0.049，P=0.015)差异均存在统计学意义。而无HRCA组和仅包含一种HRCA组患者在PFS率(P=0.379)、OS率(P=0.135)以及TTR(P=0.642)、DOR(P=0.209)均无明显统计学差异。“多重打击”组患者的中位PFS、OS以及DOR明显短于仅包含一种HRCA、无HRCA组;中位TTR则较仅包含一种HRCA组、无HRCA组明显延长。
R-ISS分期联合不同组合“多重打击”对预后的影响
本研究R-ISSII期患者中，19例“多重打击”MM患者均为“双打击”，其中1q21+合并del(17p)者4例，1q21+合并t(14;16)者9例，1q21+合并t(4;14)者6例。R-ISSIII期患者中28例“多重打击”MM患者包括22例“双打击”、6例“三打击”，“双打击”患者中1q21+合并del(17p)者6例，1q21+合并t(14;16)者5例，1q21+合并t(4;14)者9例，del(17p)合并t(4;14)者1例，1q21+合并TP53突变者1例。R-ISSIII期患者中，“双打击”与“三打击”2组患者中位PFS时间分别为14.0和12.0个月，中位OS时间分别为17.0和13.0个月，2组间PFS率(P=0.910)和OS率(P=0.623)差异均无统计学意义(图2A、B)。不同HRCA组合的“双打击”患者中，对1q21+合并t(4;14)、1q21+合并t(14;16)、1q21+合并del(17p)3种比例较高的患者进行生存分析，结果显示，R-ISSII期患者中，3者的PFS率(P=0.016)和OS率(P=0.006)差异有统计学意义(图3A、B)，3者的中位PFS时间分别为20.0个月、17.0个月和12.0个月，中位OS时间分别为23.0、22.0和14.0个月。R-ISSIII期患者中，3者的PFS率(P=0.001)和OS率(P=0.001)差异亦具有统计学意义(图3C、D)，3者的中位PFS时间分别为17.0、16.0和9.0个月，中位OS时间分别为20.0、18.0和11.0个月。不同R-ISS分期下对三种不同的“双打击”患者两两比较，结果显示，1q21+合并t(4;14)和1q21+合并del(17p)、1q21+合并t(14;16)和1q21+合并del(17p)的PFS率(P<0.05)和OS率(P<0.05)差异均有统计学意义，而1q21+合并t(4;14)和1q21+合并t(14;16)2组间PFS率(P>0.05)和OS率(P>0.05)均无统计学差异。
讨论
MM是血液系统第二大肿瘤，目前，仍是一种不能完全治愈的疾病。有研究表明，MM患者在临床表现和预后上存在着很大的异质性[16]，因此，尽早识别出高危患者是改善MM患者预后的关键。遗传学异常是MM患者危险度分层的基础，几乎所有MM患者均携带不同数目的CA。MM患者的肿瘤细胞在骨髓中比例较低且分布不均匀，浆细胞分选可以显著提高遗传学的异常检出率[17]，故本研究对MM患者骨髓标本均经过CDl38磁珠分选后进行FISH检测。
Shah等[18]和Walker等[19]分别于2018年和2019年对初治MM患者进行了回顾性研究，从大样本的骨髓瘤数据中定义了多重打击骨髓瘤。Shah等[18]定义的双打击或三打击骨髓瘤为下列任意2个或3个打击:①t(4;14)、t(14;16)、t(14;20)之一;②1q21获得(≥3个拷贝);③17p缺失。Walker等[19]定义的双打击骨髓瘤为:①双等位TP53失活;或②ISS分期Ⅲ期和CKS1B扩增(≥4个拷贝)。目前，FISH检测未常规描述1q21扩增拷贝数的变化，故临床实施较为受限。当前常用的RISS分期系统HRCA包括del(17p)、t(4;14)和t(14;16)，但尚未进一步比较RISSII期和III期患者中携带不同数目HRCA患者的生存差异。本研究按照mSMART3.0定义的“多重打击”概念联合R-ISS分期，回顾性分析了220例MM患者，“双打击”患者41例(18.6%)，较原瑞凤等[8]报道(14.3%)略高;“三打击”患者5例(2.7%)，这与国内报道(2.9%)基本一致[8]。在预后分析中，R-ISSII期中“多重打击”患者的中位PFS和OS时间分别为20.0和25.0个月，R-ISSIII期中“多重打击”患者的中位PFS和OS时间分别为12.0和16.0个月，均明显低于无HRCA和仅包含一种HRCA的患者，这与刘雪莲等[19]报道的中位PFS时间(12.1个月)和中位OS时间(29.3个月)存在较大差异，原因可能与本组病例纳入了R-ISS分期，以及患者民族结构不同，初治基线水平、治疗方案差异等因素有关，还需要进一步积累病例深入研究加以证实。本研究初次应用生存分析比较携带不同数目HRCA患者的TTR及DOR，结果显示，“多重打击”患者达到第一次缓解时间较另外两组患者明显延长，并且持续缓解时间也较另外两组患者显著缩短，这进一步证实了“多重打击”MM患者持续缓解时间更短、疾病更容易复发、预后差。本研究以R-ISS分期联合不同HRCA数目(即0、1、≥2种)进行分组，发现携带不同数目HRCA的患者间存在生存差异，这一结果强调了基于携带不同数目的细胞遗传学异常对于完善MM预后分层的重要性。
有多项研究报道，“多重打击”MM患者预后差[18-22]，本研究中不同R-ISS分期下“多重打击”MM患者的预后明显差于无HRCA和仅包含1种HRCA患者，这与国外研究一致，但目前鲜有比较不同的“双打击”组合对预后的影响。本研究进一步比较了R-ISSII期和III期中1q21+合并t(4;14)、1q21+合并t(14;16)、1q21+合并del(17p)3种不同“双打击”组合的预后，生存分析结果显示，1q21+合并del(17p)的预后最差，1q21+合并t(14;16)的中位PFS和OS时间较1q21+合并t(4;14)的MM患者缩短，但无明显统计学差异。Grzasko等[23]研究表明，1q21+是MM独立的不良预后因素，且1q21+合并del(17p)的患者较仅携带1q21+患者的PFS、OS明显缩短，Boyd等[21]研究发现，携带del(17p)患者的中位OS时间短于携带不良IgH重排[t(4;14)、t(14;16)、t(14;20)]的患者，这提示，1q21+合并del(17p)患者的预后更差。另外，本研究中所有患者均接受以硼替佐米为基础的诱导化疗方案，有研究表明，硼替佐米可以改善部分TP53缺失患者的预后[24-25]，但是在临床上，硼替佐米耐药的问题是不可避免的，有报道证实，约1/3TP53缺失患者对硼替佐米治疗无效或者既往使用但却产生耐药;同时部分1q21+患者在使用含有硼替佐米治疗方案时生存无显著改善，这提示，其可能与硼替佐米耐药有关[26]。1q21+合并del(17p)患者的预后最差，是否与对硼替佐米的双重耐药性相关，有待于继续积累病例，扩大样本量进一步研究证实。
综上所述，本研究证实了不同“多重打击”组合的MM患者预后差异明显。同种R-ISS分期下，“多重打击”MM患者预后更差，R-ISS分期与多重打击相结合能够更早、更准确地对初诊MM患者进行危险分层，有利于更精准判断MM患者的预后，为个体化治疗提供依据。——论文作者：孙慧敏1，翟顺生2，李燕2*
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