摘要：目的探讨长链非编码RNA(longnon-codingRNA，lncRNA)前列腺癌基因表达标记1(prostatecancergeneexpressionmarker1，PCGEM1)对调控miR-506-3p/RAB22A轴介导口腔鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用。方法正常人口腔角质形成细胞(normalhumanoralkeratinocyte，NHOK)及口腔鳞癌细胞HSC-3、SCC-25、CAL27，采用实时荧光定量PCR检测细胞lncRNAPCGEM1、miR-506-3p和RAB22AmRNA相对表达量，采用Westernblot检测RAB22A蛋白相对表达量，筛选与NHOK细胞差异最明显的细胞进行后续实验。HSC-3细胞分为5组，分别转染si-PCGEM1(si-PCGEM1组)、miR-506-3pmimics(miR-506-3p组)、si-RAB22A(si-RAB22A组)、si-PCGEM1+anti-miR-506-3p(si-PCGEM1+anti-miR-506-3p组)、si-PCGEM1+pcDNA-RAB22A(si-PCGEM1+pcDNA-RAB22A组)，转染48h后，采用MTT比色法检测5组细胞存活率，采用Transwell小室实验检测迁移细胞数和侵袭细胞数，采用Westernblot检测5组细胞周期蛋白D1(cyclinD1)、基质金属蛋白酶(matrixmetalloprotease，MMP)-2和MMP-9蛋白相对表达量。采用双荧光素酶活性检测lncRNAPCGEM1、miR-506-3p、RAB22A之间的靶向关系。结果口腔鳞癌细胞HSC-3、SCC-25、CAL27中lncRNAPCGEM1、RAB22AmRNA和蛋白相对表达量高于NHOK细胞(P<0.05)，miR-506-3p相对表达量低于NHOK细胞(P<0.05);SCC-25、CAL-27细胞miR-506-3p相对表达量低于HSC-3细胞(P<0.05)，HSC-3细胞与NHOK细胞差异最大。si-PCGEM1+anti-miR-506-3p组、si-PCGEM1+pcDNA-RAB22A组细胞存活率[(92.14±9.21)%、(87.26±8.73)%]、迁移细胞数[(201.56±20.16)、(196.08±19.61)个]、侵袭细胞数[(134.36±13.43)、(130.57±13.06)个]高于si-PCGEM1组[(53.07±5.31)%、(105.67±10.57)个、(71.24±7.12)个]、miR-506-3p组[(63.04±6.31)%、(102.02±10.20)个、(61.02±6.10)个]、si-RAB22A组[(47.25±4.73)%、(135.29±13.53)个、(51.01±5.11)个](P<0.05)，RAB22A、cyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白相对表达量高于si-PCGEM1组、miR-506-3p组、si-RAB22A组(P<0.05);以上指标si-PCGEM1组、miR-506-3p组、si-RAB22A组组间两两比较及si-PCGEM1+anti-miR-506-3p组与si-PCGEM1+pcDNA-RAB22A组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。lncRNAPCGEM1靶向miR-506-3p，miR-506-3p靶向RAB22A。结论下调lncRNAPCGEM1表达可通过调控miR-506-3p/RAB22A轴抑制口腔鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。
关键词：口腔鳞癌;lncRNAPCGEM1;miR-506-3p;RAB22A;增殖;迁移;侵袭
口腔鳞癌约占口腔癌的90%[1]，患者5年生存率<50%[2]。长链非编码RNA(longnon-codingRNA，lncRNA)是各种基因表达和生物学过程中的重要调节剂。前列腺癌基因表达标记1(prostatecancergeneexpressionmarker1，PCGEM1)是一种致癌基因，在胃癌[3]、前列腺癌[4]中表达上调，可诱导癌细胞的增殖、迁移、侵袭或抑制凋亡。PCGEM1通过靶向miR-182/FBXW11轴促进宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭[5]。前列腺癌细胞系中miR-506-3p表达下调可发挥抑癌作用，多肽-N-乙酰氨基半乳糖转移酶4是miR-506-3p的直接靶标，可逆转肿瘤的抑制功能[6]。RAB22A是一种癌蛋白，在肝癌中高表达，发挥促癌基因功能[7]。本研究探讨口腔鳞癌细胞lncRNAPCGEM1表达情况及其是否通过miR-506-3p/RAB22A轴调控口腔鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭过程，为口腔鳞癌发病分子机制研究奠定基础，报道如下。
1材料与方法
1.1一般材料正常人口腔角质形成细胞(normalhumanoralkeratinocyte，NHOK)、口腔鳞癌细胞HSC-3、SCC-25、CAL-27(美国典型培养物保藏中心)，均在含体积分数10%胎牛血清、100u/mL青霉素/链霉素的DMEM培养基，37℃，体积分数5%CO2饱和湿度培养箱中培养，培养至对数生长期进行实验。
1.2方法
1.2.1主要试剂si-PCGEM1、miR-506-3pmimics、anti-miR-506-3p、pcDNA-RAB22A、si-RAB22A(上海GenePharma公司)，兔抗RAB22A、细胞周期蛋白D1(cyclinD1)、基质金属蛋白酶(matrixmetalloprotease，MMP)-2、MMP-9抗体、山羊抗兔二抗(英国Abcam公司)。
1.2.2实时荧光定量PCR检测lncRNAPCGEM1、miR-506-3p、RAB22AmRNA相对表达量4种细胞使用TRIzol试剂抽提总RNA，cDNA合成采用反转录试剂盒，应用ABI7500PCR系统，采用实时荧光定量PCR进行检测。引物序列见表1。反应体系：12.5μLSYBR-Green，5μLcDNA，1μL正向引物，1μL反向引物，RNase-freeWater补足25μL。反应条件：95℃30s;95℃5s，60℃34s，40个循环;95℃15s，60℃60s，95℃15s。将lncRNAPCGEM1、RAB22AmRNA相对表达归一化为β-actin，将miR-506-3p的相对表达归一化为U6，计算方法为2-ΔΔCt。筛选与NHOK细胞差异最明显的口腔鳞癌细胞进行后续实验。
1.2.3Westernblot法检测RAB22A蛋白相对表达量4种细胞在RIPA裂解缓冲液中裂解，采用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白质浓度。使用SDS-PAGE分离40μg蛋白质，转移至PVDF膜。将PVDF膜在体积分数5%脱脂牛奶中封闭，并与一抗孵育。其中一抗RAB22A稀释度为11000，对照β-actin稀释度为12000。随后，将PVDF膜与山羊抗兔二抗孵育，并使用ECL试剂检测蛋白质表达，以β-actin灰度值为对照，计算RAB22A蛋白相对表达量。筛选与NHOK细胞差异最明显的口腔鳞癌细胞进行后续实验。
1.2.4细胞分组及转染将HSC-3细胞接种于6孔板，细胞融合至70%时，分为si-PCGEM1组、miR-506-3p组、si-RAB22A组、si-PCGEM1+anti-miR-506-3p组和si-PCGEM1+pcDNA-RAB22A组，采用Lipofectamine2000试剂分别转染si-PCGEM1、miR-506-3pmimics、si-RAB22A、si-PCGEM1+anti-miR-506-3p、si-PCGEM1+pcDNA-RAB22A。转染48h后进行后续实验。
1.2.5MTT比色法检测细胞存活率各组HSC-3细胞(2×103个/孔)置于96孔培养板中，48h后评估细胞存活情况。MTT(5g/L)添加到每孔中，4h后继续添加150μL二甲基亚砜。在酶标仪上于490nm测量吸光度(opticaldensity，OD)值。细胞存活率(%)=(1-OD值实验组/OD值对照组)×100%。
1.2.6Transwell小室实验检测迁移细胞数和侵袭细胞数使用预涂有Matrigel基质凝胶的Transwell小室检测侵袭细胞数，500μL含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基被添加到下腔室，转染后的HSC-3细胞在无血清DMEM培养液中饥饿过夜。随后，在200μL无血清培养基中重悬(1×105个)，并将其加入上腔室。24h后，对入侵膜下表面的细胞进行固定、结晶紫染色、计数。检测迁移细胞数时，Transwell上室不铺Matrigel基质凝胶，其余操作同侵袭细胞数检测。
1.2.7Westernblot法检测RAB22A、cyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白相对表达量收集HSC-3细胞，检测RAB22A、cyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白相对表达量，方法同1.2.3。
1.2.8双荧光素酶报告实验采用Starbase预测lncRNAPCGEM1和miR-506-3p、miR-506-3p和RAB22A的核苷酸序列是否存在互补配对现象。HSC-3细胞分为miR-506-3p组和miR-NC组，分别转染miR-506-3pmimics和miR-NC。构建含有miR-506-3p结合位点的lncRNAPCGEM1-野生型(WT)及突变型(MUT)报告基因载体，miR-506-3p组和miR-NC组分别共转染lncRNAPCGEM1-WT和lncRNAPCGEM1-MUT;构建含有miR-506-3p结合位点的RAB22A-3’UTR野生型(WT)及突变型(MUT)报告基因载体，miR-506-3p组和miR-NC组细胞分别共转染RAB22A-3’UTR-WT和RAB22A-3’UTR-MUT。转染48h后检测2组细胞分别共转染lncRNAPCGEM1和RAB22A-3’UTR时的双荧光素酶活性。
1.2.9不同转染条件下HSC-3细胞miR-506-3p相对表达量比较将HSC-3细胞分为pcDNA-NC组、pcDNA-PCGEM1组、si-NC组、si-PCGEM1组，分别转染pcDNA-NC、pcDNA-PCGEM1、si-NC、si-PCGEM1，检测miR-506-3p相对表达量，方法同1.2.2。1.2.10增强或沉默miR-506-3p表达的HSC-3细胞RAB22A蛋白相对表达量比较HSC-3细胞分为miR-NC组、miR-506-3p组、anti-miR-NC组、anti-miR-506-3p组，分别转染miR-NC、miR-506-3pmimics、anti-miR-NC、anti-miR-506-3p，检测RAB22A蛋白相对表达量，方法同1.2.3。
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1.3统计学处理应用SPSS22.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(x珚±s)表示，2组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验;检验水准α=0.05。
2结果
2.14种细胞lncRNAPCGEM1、miR-506-3p、RAB22AmRNA和蛋白相对表达量比较HSC-3、SCC-25、CAL-27细胞lncRNAPCGEM1、RAB22AmRNA和蛋白相对表达量高于NHOK细胞(P<0.05)，miR-506-3p相对表达量低于NHOK细胞(P<0.05)。SCC-25、CAL-27细胞miR-506-3p相对表达量低于HSC-3细胞(P<0.05)，SCC-25细胞与CAL-27细胞比较差异无统计学意义(P>0.05)。选择与NHOK细胞差异最大的HSC-3细胞进行后续实验。见表2及图1。
2.25组细胞存活率比较培养48h，5组细胞存活率比较差异有统计学意义(P<0.05)。si-PCGEM1+anti-miR-506-3p组、si-PCGEM1+pcDNA-RAB22A组细胞存活率高于si-PCGEM1组、miR-506-3p组、si-RAB22A组(P<0.05)，si-PCGEM1组、miR-506-3p组、si-RAB22A组组间两两比较及si-PCGEM1+anti-miR-506-3p组与si-PCGEM1+pcDNA-RAB22A组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。
2.35组迁移细胞数、侵袭细胞数比较培养48h，5组迁移细胞数、侵袭细胞数比较差异有统计学意义(P<0.05)。si-PCGEM1+anti-miR-506-3p组、si-PCGEM1+pcDNA-RAB22A组迁移细胞数、侵袭细胞数多于si-PCGEM1组、miR-506-3p组、si-RAB22A组(P<0.05)，si-PCGEM1组、miR-506-3p组、si-RAB22A组组间两两比较及si-PCGEM1+anti-miR-506-3p组与si-PCGEM1+pcDNA-RAB22A组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3及图2。
2.45组细胞RAB22A、cyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白相对表达量比较5组细胞RAB22A、cyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白相对表达量比较差异有统计学意义(P<0.05)。si-PCGEM1+anti-miR-506-3p组、si-PCGEM1+pcDNA-RAB22A组RAB22A、cyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白相对表达量高于si-PCGEM1组、miR-506-3p组、si-RAB22A组(P<0.05)，si-PCGEM1组、miR-506-3p组、si-RAB22A组组间两两比较及si-PCGEM1+anti-miR-506-3p组与si-PCGEM1+pcDNA-RAB22A组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4及图3。
2.5双荧光素酶报告实验结果Starbase预测发现lncRNAPCGEM1和miR-506-3p具有靶向结合位点(图4a)。双荧光素酶活性检测结果显示，miR-506-3p组共转染lncRNAPCGEM1-WT时的细胞荧光素酶活性低于miR-NC组(P<0.05)，共转染lncRNAPCGEM1-MUT时的细胞荧光素酶活性与miR-NC组比较差异无统计学意义(P>0.05)。Starbase预测发现miR-506-3p和RAB22A存在靶向结合位点(图4b)。双荧光素酶活性检测结果显示，miR-506-3p组共转染RAB22A-3’UTR-WT时的细胞荧光素酶活性低于miR-NC组(P<0.05)，共转染RAB22A-3’UTR-MUT时的细胞荧光素酶活性与miR-NC组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。
2.6不同转染条件下细胞miR-506-3p和RAB22A蛋白相对表达量比较pcDNA-PCGEM1组miR-506-3p相对表达量低于pcDNA-NC组(P<0.05)，si-PCGEM1组miR-506-3p相对表达量高于si-NC组(P<0.05)，即上调PCGEM1表达可减少miR-506-3p表达，下调PCGEM1表达可增加miR-506-3p表达。miR-506-3p组RAB22A蛋白相对表达量低于miR-NC组(P<0.05)，anti-miR-506-3p组RAB22A蛋白相对表达量高于anti-miR-NC组(P<0.05)，即上调miR-506-3p表达可降低RAB22A蛋白表达，下调miR-506-3p表达可增加RAB22A蛋白表达(P<0.05)。见表6-7及图5。
3讨论
研究[8-9]发现，lncRNA通过转录、表观遗传和转录后水平调控基因表达而调节肿瘤的生物学功能，其异常表达是参与癌症发病机制的关键顺式或反式调节因子，提示lncRNA可能成为人类肿瘤辅助诊断或治疗的新靶点。本研究结果显示，口腔鳞癌HSC-3、SCC-25、CAL-27细胞lncRNAPCGEM1相对表达量明显高于NHOK细胞，与相关研究结果[3-5]相符，提示lncRNAPCGEM1可能作为口腔鳞癌的致癌因子，促进肿瘤进展。本研究结果显示，si-PCGEM1+anti-miR-506-3p组、si-PCGEM1+pcDNA-RAB22A组细胞存活率、迁移细胞数、侵袭细胞数及RAB22A、cyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白相对表达量均高于si-PCGEM1组、miR-506-3p组、si-RAB22A组;说明低表达lncRNAPCGEM1可抑制HSC-3细胞存活、迁移、侵袭及cyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白的表达，提示lncRNAPCGEM1对口腔鳞癌的发生、发展有促进作用，下调其表达可有效抑制口腔鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭。研究[10]发现lncRNAPCGEM1可通过上调RhoA途径而诱导卵巢上皮癌细胞的增殖、迁移和侵袭，减少细胞凋亡。lncRNAPCGEM1可能通过作为miR-129-5p的竞争性内源RNA上调STAT3表达，影响子宫内膜癌的发生、发展，促进子宫内膜癌细胞的增殖、迁移和侵袭，抑制细胞凋亡[11]。因此，本研究可为lncRNAPCGEM1作为致癌基因影响肿瘤进程的观点提供新证据。
miRNA可调节与肿瘤发生有关的过程(如炎症、细胞周期、应激反应、分化、凋亡和侵袭)，是潜在的致癌因子或肿瘤抑制因子[12]。miR-506-3p是多种肿瘤的抑制因子，在人骨肉瘤中其表达下调可靶向RAB3D转录，抑制骨肉瘤细胞增殖和侵袭[13]。在口腔鳞癌中miR-506呈低表达，过表达miR-506时可减弱口腔鳞癌细胞生长和迁移、侵袭能力，靶向GATA结合蛋白6可解释其肿瘤抑制机制[14]。本研究结果显示，miR-506-3p组共转染lncRNAPCGEM1-WT时的细胞荧光素酶活性低于miR-NC组，共转染lncRNAPCGEM1-MUT时的细胞荧光素酶活性与miR-NC组比较差异无统计学意义;说明高表达miR-506-3p可明显抑制HSC-3细胞存活、迁移、侵袭及cyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表达，与相关报道[13-14]一致;提示高表达miR-506-3p可抑制口腔鳞癌细胞的生长和转移，具有肿瘤抑制功能。
RAB22A是Ras相关的小GTPase家族成员，在结肠癌、肺癌中呈高表达，促进结肠癌的发展[15]，沉默RAB22A表达可抑制肺癌细胞的迁移和侵袭[16]。本研究结果显示，si-PCGEM1+anti-miR-506-3p组、si-PCGEM1+pcDNA-RAB22A组RAB22A蛋白相对表达量高于si-PCGEM1组、miR-506-3p组、si-RAB22A组;说明口腔鳞癌细胞RAB22AmRNA和蛋白表达明显上调;提示低表达RAB22A具有抑制细胞增殖、迁移、侵袭的作用。本研究双荧光素酶报告实验结果显示，lncRNAPCGEM1可靶向调控miR-506-3p的表达，miR-506-3p靶向RAB22A;pcDNA-PCGEM1组miR-506-3p相对表达量低于pcDNA-NC组，si-PCGEM1组miR-506-3p相对表达量高于si-NC组;说明下调PCGEM1对口腔鳞癌细胞HSC-3增殖、迁移和侵袭具有抑制作用，这种抑制作用可被miR-506-3p低表达逆转;miR-506-3p组RAB22A蛋白相对表达量低于miR-NC组，anti-miR-506-3p组RAB22A蛋白相对表达量高于anti-miR-NC组;说明上调RAB22A时可逆转PCGEM1下调抑制HSC-3增殖、迁移和侵袭的作用;提示靶向miR-506-3p调控RAB22A的表达是lncRNAPCGEM1影响口腔鳞癌细胞增殖、迁移、侵袭的重要途径之一。
本研究结果提示，lncRNAPCGEM1、RAB22A在口腔鳞癌细胞中表达上调，miR-506-3p在口腔鳞癌细胞中表达下调。低表达lncRNAPCGEM1可抑制口腔鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，其机制可能与调控miR-506-3p/RAB22A轴有关，可为口腔鳞癌的诊断和治疗提供候选标志物与靶点。——论文作者：陈苑1，景向东1，刘彩奇1，李佳殷
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