摘要生物标志物一直是医学领域的研究热点.目前主要以实时荧光定量PCR技术作为分子诊断的检测手段，用于大样本的检测，但该技术具有限制性，会导致假阴性.作为第三代PCR的数字PCR技术，优化并提高了检测灵敏度，无需标准曲线实现绝对定量检测，大大提高了检测的精准度，尤其是对于低表达RNA的检测，显得更为出色.本研究以hsa_circ_0061276为例，利用微滴式数字PCREvaGreen染料法对血浆中hsa_circ_0061276的拷贝数进行绝对定量地检测，成功检测出胃癌患者血浆中hsa_circ_0061276的具体拷贝数.因此，数字PCR可作为新型检测技术在临床实际应用中有较大推广价值.
关键词数字PCR，环状RNA，生物标志物
聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)技术发展已非常成熟，且广泛应用到基础研究和实际检验工作中[1].为了实现更加精确地检测，人们采用第三代PCR——数字PCR[2]，其中微滴式数字PCR(dropletdigitalPCR,ddPCR)是目前使用较广的一种数字PCR检测技术，它主要有4个应用方向：绝对定量[3]、稀有拷贝检测[4]、拷贝数变异分析[5]和确定基因表达水平[6].ddPCR被认为是检测多种癌症相关基因变异的可靠工具[7].因此将其应用于肿瘤标志物的检测将大大提高检测的灵敏度和准确性.
环状RNA(circularRNA,circRNA)是近年来医学研究领域的新型热点分子，其独特的环状结构决定了它们高度稳定性和广泛存在于各种体液中.将circRNA作为生物标志物，为癌症早期诊断、监测预后和判断疗效创造了新的可能[8].由于实时荧光定量PCR受限于本身实验技术的相对较低灵敏度，会出现检测假阴性，因此不利于对低表达基因的检测,而ddPCR提高了检测灵敏度，减少假阴性率.本实验室前期研究证明了hsa_circ_0061276具有作为胃癌诊断标志物的优势[3].为此，本研究以hsa_circ_0061276为例，建立逆转录微滴式数字PCR染料法检测胃癌患者血浆中hsa_circ_0061276水平的方法,希望为circRNA运用于肿瘤诊断提供新思路.
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验仪器
本实验中所使用的主要仪器包括QX200TM微滴发生仪、PX1TM热封仪、T100TM热循环仪和QX200TM微滴分析仪等，均购于美国Bio-Rad公司.
1.1.2引物设计与合成
先在circRNA常用数据库circBase(http://circrna.org/)中下载hsa_circ_0061276序列，然后使用Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)在线设计hsa_circ_0061276的跨连接点的扩增引物(图1)，以确保只扩增circRNA，而不扩增线性RNA。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物具体序列见表1.
相关期刊推荐：《生物化学与生物物理进展》(月刊)创刊于1974年，主要报道：生物化学、分子生物学、生物物理学及神经科学等领域的国内外最新进展。栏目设置：微型述评、综述与专论、研究报告、技术与方法、研究快报等。
本实验利用染料法完成ddPCR的检测.ddPCREvaGreenSupermix(购于Bio-Rad公司)用于反应体系的构建.EvaGreen微滴生成油(购于Bio-Rad公司)用于包裹核酸分子以生成微滴.逆转录试剂盒购自美国Promega公司.
1.2方法
1.2.1提取血浆总RNA、逆转录成cDNA
①在1.5ml离心管中加入250μL血浆和750μLTRIzolLS，旋涡震荡后4℃冰箱放置5min;②加200μL三氯甲烷混匀，4℃冰箱放置5min;③4℃、12000r/min离心15min后，取上清至干净1.5ml离心管中，加入500μL异丙醇，旋涡震荡，4℃静置15min;④12000r/min，4℃离心10min;⑤弃上清，加入1ml75%乙醇，旋涡震荡;⑥12000r/min，4℃离心5min，弃上清;⑦继续离心3min，弃上清，干燥3min;⑧加20μL无RNA酶水溶解RNA;⑨取10.5μLRNA和9.5μL逆转录混合液，按照说明书逆转录成cDNA.
1.2.2ddPCR检测
按照表2配置ddPCR反应体系.①先用排枪将反应体系转移到微滴发生卡中间一排，然后在最下面一排每孔加入70μLEvaGreen微滴生成油，放入QX200TM微滴生成仪中生成微滴;②用排枪吸取上排微滴(每孔40μL)转移至96孔板;③用180℃预热过的热封仪进行封膜;④将96孔板放入PCR仪中进行扩增反应，反应条件为：95℃预变性5min;95℃变性30s、57℃退火60s，循环40次;4℃，5min;90℃，5min;4℃保存;⑤PCR反应结束后将96孔板放入微滴分析仪中逐一进行读数.
1.2.3微滴分析仪结果分析
①打开Quantasoft软件;②清洗管路;③填写样品信息，选择绝对定量(absolutequantification,ABS);④点击运行;⑤导出数据和图片.
2结果
2.1测序结果
为验证ddPCR的准确性，将测序结果(图2)与hsa_circ_0061276的序列进行比对。结果显示，ddPCR产物序列与hsa_circ_0061276序列完全匹配，并通过剪接点.这说明引物设计正确，成功扩增hsa_circ_0061276.
2.2阴性对照
每次实验的第一个孔用来做阴性对照(negativecontrol,NEG).此孔不加模板，用H2O替代cDNA，理论上不会检测出拷贝数，显示为NOCALL，用来判定是否有引物二聚体生成.
2.3阳性结果
本实验利用油包水方法将20μL液体平均分配到数万个微滴中.图3A显示了检测到的总微滴数、阳性微滴数(左边数值)和阴性微滴数(右边数值).微滴总数通常在1.2万以上说明微滴成功生成，阳性微滴数为能检测到荧光信号的微滴数，而阴性微滴数为没有待测核酸分子的微滴数.微滴读数仪能精准地判读阳性微滴和阴性微滴，分析软件将阴性微滴的比例带入Poisson分布公式，即可直接得到该样本的绝对拷贝数，单位为每μL样本所含拷贝数.本实验共检测12例胃癌患者血浆样本，总微滴数均超过1.4万.它们的绝对拷贝数分别为2.9Copies/μL、2.2Copies/μL、3.2Copies/μL、1.4Copies/μL、3Copies/μL、1.02Copies/μL、0.81Copies/μL、0.41Copies/μL、1.4Copies/μL、0.69Copies/μL、0.41Copies/μL和2.3Copies/μL(图3B).
微滴图(图4)中可以直观地观察阳性微滴(蓝色圆点)和阴性微滴(灰色圆点)在同一孔中的荧光强度差异，横坐标(EventNumber)为实时记录的微滴数，纵坐标(振幅,Amplitude)为荧光强度.阳性微滴荧光强度在15000左右，阴性微滴荧光强度在5000以下，两者分界明显，背景干净且无弥散现象.这些结果说明成功利用ddPCR染料法检测到血浆中hsa_circ_0061276的具体拷贝数.
3讨论
早发现、早诊断、早治疗是提高疾病治愈率的最有效方法，尤其像胃癌这种早期无特异性临床表现的疾病，往往发现时已错过最佳治疗的时间.然而，目前对于胃癌诊断的金标准为病理组织活检，而它是一种有创检查，不利于早期筛查，因此寻找一种新型的胃癌标志物对于其早期诊断具有重大意义.本实验室研究发现血浆hsa_circ_0061276具有作为胃癌诊断生物标志物的潜力[3].
对于肿瘤的大多数研究都会应用qRT-PCR来进行相关基因表达水平相对定量检测.目前实时荧光定量PCR是临床上应用广泛的检测手段，染料法进行定量检测成本较低，但引物二聚体的干扰可能会导致定量不准确，因而降低了其灵敏度.为了解决这一问题，本研究使用RT-ddPCR来检测血浆中hsa_circ_0061276的拷贝数，绝对定量地检测让实验结果更加真实和可信.数字PCR通过采用染料法或探针法实现定量检测，而选择染料法比探针法更为经济，更适用于普通分子生物实验室和常规临床检验科[9].
ddPCR的应用涉及多个研究领域，例如：检测胃癌患者组织和血浆样品中人表皮生长因子受体-2(humanepidermalgrowthfactorreceptor2,HER2)的拷贝数[10]，检测黑色素瘤患者血浆BRAFV600E突变[11]，等等.在2020年突发的新型冠状病毒肺炎(coronavirusdisease2019，COVID-19)疫情中，ddPCR技术在检测其病原体——严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2，SARS-CoV-2)中体现出良好的优越性[12-14].有研究报道，由于病毒载量低和RT-PCR技术的局限性，不可避免地会产生假阴性，导致无法及时诊断，而ddPCR可减少假阴性，从而可以对疑似患者进行快速治疗和正确管理[12,13].因此，有专家建议使用ddPCR检测SARS-CoV-2和对阳性患者进行随访直至完全缓解[14].我们的研究发现，ddPCR更适合于检测低表达的circRNA，无需标准曲线实现绝对定量(图3B)，对于结果的分析更加方便.
在进行ddPCR实验时，本研究也发现了一些问题需要引起操作者注意.例如：qRT-PCR与ddPCR在配制20μL混合体系之前的步骤是一致的，前者完成后即可PCR扩增检测，但后者还需要在扩增完成后进行微滴生成、转移微滴至96孔板进行微滴上机分析等步骤.微滴生成受环境温度和湿度等因素影响，微滴转移过程要十分小心，避免微滴破碎;微滴生成油开启后应尽快用完，如变浑浊会影响实验结果的准确性.总之，使用ddPCR时，样品前处理过程可能会受人为因素影响，操作过程稍为繁琐，实验时间较长不能快速出结果.另外ddPCR所使用的配套仪器设备较多，试剂耗材较qRT-PCR稍贵.然而，作为新一代核酸绝对定量检测技术，数字PCR具有明显的优势;随着技术的进步和检测成本的下降，我们相信数字PCR将在临床诊断和基础研究中发挥更大的作用.——论文作者：阮垚郭俊明肖丙秀
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