[摘要]:目的利用代谢组学探讨兔体外循环(ECC)期间心肌代谢变化。方法18只新西兰白兔随机分为对照组(C组，n=6)、缺血组(I组，n=6)、缺血再灌注组(IR组，n=6)。I组与IR组行右腋动脉、右房插管建立ECC，I组主动脉阻断120min后取左室心肌组织;IR组主动脉阻断120min开放，心肌恢复灌注120min后取左室心肌组织;C组正中开胸、右腋动脉、右房插管后取左室心肌组织。采用气相色谱-质谱法检测，代谢组学数据进行多元变量统计分析:主成分分析、正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)作得分图，差异物质鉴定采用OPLS-DA分析的变量重要性投影(VIP)值与独立样本t检验P<0.05，代谢物行载荷图、热力图分析，并进行差异物代谢通路分析。结果缺血期间代谢差异不显著(Q2Y=0.357)，13个代谢物质存在统计学差异(所有VIP差异物>1，P差异物<0.05)，主要涉及鸟氨酸循环及嘧啶代谢通路。再灌注期间，心肌代谢发生显著变化(Q2Y=0.714)，82个代谢物质存在统计学差异(所有差异代谢物VIP值>1，P差异物<0.05)，不饱和脂肪酸及其衍生物代谢(花生四烯酸、油酸、亚油酸、茉莉酸甲酯)上调，与黄嘌呤氧化酶系统相关的产物次黄嘌呤、黄嘌呤核苷均增加，腺苷相关代谢产物及三羧酸循环琥珀酸及其代谢产物下调。结论基于兔ECC灌注HTK液模型的代谢组学分析表明缺血期间心肌代谢变化不显著，但再灌注期间心肌代谢显著上调，参与氧化应激的氨基酸、不饱和脂肪酸、嘌呤代谢明显增加，抗氧化剂谷氨酰胺生成减少。
[关键词]:体外循环;代谢组学;心肌缺血再灌注;兔
体外循环(extacorporealcirculation，ECC)期间主动脉阻断与开放难以避免心肌缺血再灌注损伤(ischemiareperfusioninjury，IRI))，可能促进线粒体通透性转换孔开放、免疫系统激活、活性氧簇释放、心肌细胞水肿等[1]，因此ECC期间心肌保护策略需关注ECC前的心肌代谢准备，改善ECC诱发的炎症反应，调节心肌氧耗并进行心肌的“训练”[1]。其中，代谢状态作为心肌能量供应及功能状况的反映，可能在ECC期间发生复杂变化，目前临床常用的心肌保护液-HTK液，具有酸缓冲能力、含有酮戊二酸可补充能量代谢底物、色氨酸可稳定细胞膜等优良特性。前期研究发现HTK液可降低主动脉开放后心肌氧耗[2]，但未全面分析心肌代谢变化。代谢组学利用分析检测技术，如气相色谱-质谱联用(gaschromatography-massspectrometer，GC-MS)、液相色谱-质谱联用，可对小分子代谢产物进行全面分析，有助于疾病诊断和发病机制研究[3]。本研究旨在利用兔ECC模型，采用主动脉阻断与开放、HTK液心肌灌注，模拟临床实际，对ECC期间心肌进行代谢组学分析。
1资料与方法
1.1实验动物实验经动物伦理委员会批准(2012-4-10-GZR)，选择15～20周龄的新西兰白兔，体重2～3.5kg，随机分为对照组(C组，n=6)、缺血组(I组，n=6)、缺血再灌注组(IR组，n=6)。12只新西兰白兔作为I组、IR组献血兔用于ECC管道预充和术中输血，具体方法同前期研究[4]。实验动物术前禁食6h，禁饮2h。
1.2耗材与试剂ECC模型采用16F静脉插管、婴儿型膜肺(TerumoCapioxFX05)、双头滚压泵，心肌灌注管采用20G中心静脉插管。代谢组学分析采用气相色谱仪(Agilent7890A，美国)、质谱仪(Agilent5975C，美国)、30m×250μm×0.25μm毛细管柱(AgilentDB-5MS，美国)。代谢组学内标采用L-2-氯苯丙氨酸，衍生化试剂采用N，O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺。
1.3ECC模型建立入室开通耳缘静脉，麻醉诱导依次采用芬太尼(3μg/kg)、戊巴比妥钠(30mg/kg)、维库溴铵(0.1mg/kg)，经口气管插管机械通气。麻醉维持采用戊巴比妥钠、芬太尼、维库溴铵。右腋动脉置入16G套管针，正中开胸，充分暴露心脏和升主动脉，右心耳置入16F静脉插管。左腋动脉置入20G中心静脉导管入主动脉根部作为心肌灌注。ECC管道预充排气后开放静脉引流管、腋动脉插管，开始ECC转流，肛温降至30℃阻断主动脉，灌注HTK液40ml/kg。ECC期间维持肛温28℃左右，平均动脉压为40～60mmHg。主动脉开放前肛温复温至30℃，主动脉阻断120min后松开阻断带，恢复心肌灌注、心脏复跳，继续复温至35℃，血流动力学平稳后停机。I组主动脉阻断120min后取心肌组织，IR组主动脉阻断120min开放，心肌恢复灌注120min后取心肌组织。C组正中开胸、ECC插管后取左室心肌组织，心肌标本-80℃冰箱保存，用于代谢组学检测。
1.4代谢组学GC-MS检测取100mg心肌组织，加入L-2-氯苯丙氨酸(50μl)、体积比3∶1的甲醇氯仿混合液(0.5ml)，55Hz研磨7min后离心15min(4℃，12000rpm)，取上清行真空浓缩器干燥处理，与80μl甲氧胺盐试剂混匀，37℃孵育2h后加入100μlBSTFA，70℃孵育1h，冷却后上机检测。采用GC-MS分析，进样量为1μl，气载为氦气，气体入口流速设为3ml/min，毛细管柱气体流速1ml/min。初始温度80℃1min，以10℃/min提升至290℃，并维持290℃15min。选择单纯内标(L-2-氯苯丙氨酸)、单个样本进行预实验，内标保留时间标准差为0.00531，表明系统稳定性良好。
1.5代谢组学多元数据分析质谱峰预处理去除噪音数据，采用最小值二分之一法缺失值模拟，内标归一法数据标准化处理。采用主成分分析法(principalcomponentanalysis，PCA)和正交偏最小二乘法-判别分析(orthogonalprojectionstolatentstructures-discriminantanalysis，OPLS-DA)对数据进行多元分析，应用得分图评估样本分类。PCA采用对数转换及CTR格式化处理的数据标度换算方式，对数据进行建模分析。OPLS-DA滤除代谢物中不相关的正交变量，对非正交变量和正交变量分别分析，最大化凸显模型内部与预测主成分间的差异。OPLS-DA采用对数转换及UV格式化处理的数据标度换算方式，对第一、二主成分进行建模分析。采用7折交叉验证检验模型质量，R2Y(Y变量的可解释性)及Q2(模型的可预测性)评估模型有效性，排列实验随机200次改变Y的排列顺序获得Q2值进一步检验模型有效性。
1.6差异物代谢通路及统计学分析所有数据使用SIMCA-P13.0进行分析，计算OPLS-DA第一主成分的变量重要性投影值(variableimportanceintheprojection，VIP)的阈值，采用LECO/Fiehn代谢组学对代谢物质进行鉴定[5]。所有数据采用SPSS16.0进行统计分析，计量资料采用均数±标准差(x珋±s)表示，组间比较采用t检验。VIP值>1及t检验P<0.05鉴定差异代谢物。差异代谢物以Pearson相关系数进行聚集获得热图，采用MeV软件作载荷图。将差异物在京都基因与基因组百科全书数据库(kyotoencyclopediaofgenesandgenomicsdatabase，KEGG)中进行映射，确定代谢通路。
2结果
2.1代谢组学多元分析
2.1.1预处理结果三组心肌组织GC-MS检测获得608个质谱峰，对数据进行过滤，去除噪音数据，保留583个峰值(图1)。
2.1.2PCA分析结果所有样本处于95%置信区间内，I组与C组PCA得分图部分重叠区分不显著，R2X=0.384，Q2=-0.102。IR组与I组分布于T1两侧，互不重叠具有聚类趋势，表明再灌注期间的心肌代谢物质可能发生显著改变，PCA模型R2X=0.535，系统稳定性和实验可控性良好，数据可进一步分析(图2～3)。
2.1.3OPLS-DA分析结果所有样本处于95%置信区间内，OPLS-DA得分图示I组与C组无重叠，R2X=0.313，R2Y=0.987，Q2=0.357。I组与IR组显著区分，表明ECC可引起心肌代谢状态的显著改变(图2～3)，OPLS-DA模型R2X=0.403，R2Y=0.991，Q2=0.714。
OPLS-DA模型行7折交叉验证，I组与C组比较发现置换检验截距分别为R2=0.904，Q2=0.0165，IR组与I组比较发现置换检验截距分别为R2=0.914，Q2=-0.0841，OPLS-DA模型的稳健性良好，不存在过拟合现象，OPLS-DA模型可解释两组样本之间的差异。缺血期间及再灌注期间代谢物载荷图见图4，载荷图左右两端物质为潜在的差异代谢物。
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2.2差异代谢物鉴定及代谢通路确定差异代谢物热图表明，缺血期间代谢变化不显著，仅发现13个差异物质(图5A)，再灌注期间代谢发生明显改变，共筛选出82个差异代谢物(图5B)。KEGG分析发现缺血期间不饱和脂肪酸油酸代谢上调，尿嘧啶代谢下调，包括尿嘧啶核苷、5，6-二氢尿嘧啶生成减少。尿素循环相关产物瓜氨酸、肌酐生成减少，差异代谢物主要参与嘧啶代谢、尿素循环以及不饱和脂肪酸代谢。再灌注期间主要涉及氨基酸代谢、不饱和脂肪酸代谢、核苷酸代谢。再灌注期间上调的差异氨基酸主要为缬氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸、肌氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸。参与氧化应激的氨基酸上调，包括丝氨酸、甘氨酸、脯氨酸、苏氨酸，鸟氨酸循环激活，谷氨酰胺在再灌注期间生成减少。再灌注期间脂肪酸代谢中十五酸、棕榈酸(十六酸)、十七酸、硬脂酸(十八烷酸)、茉莉酸甲酯、甘油酸、双甘油、花生四烯酸、油酸、亚油酸生成增加，其中不饱和脂肪酸花生四烯酸、油酸、亚油酸、茉莉酸甲酯代谢上调。再灌注期间核苷酸代谢中尿嘧啶、胞嘧啶核苷、鸟嘌呤、次黄嘌呤、尿酸、黄嘌呤核苷生成增加，羧酸尿嘧啶、胞苷酸、尿苷酸生成减少。核苷酸代谢产物增加，与黄嘌呤氧化酶系统相关的产物次黄嘌呤、黄嘌呤核苷均增加，而参与了ADP合成的底物腺苷及三羧酸循环琥珀酸生成减少(图6)。
3讨论
ECC期间受人工管道、低温等因素的影响，缺血再灌注期间心肌代谢可能发生显著改变。HTK液诱导新陈代谢暂停、维持有利的代谢环境，防止细胞代谢物的丢失、维持合理的酸碱平衡，防止细胞毒性损伤[6]，但围术期心功能紊乱仍常见于临床，而从心肌代谢角度阐释可能的机制仍需进一步探索。研究证实ECC期间心肌腺苷酸发生显著改变，ECC可能诱发了能量受损及恢复延迟，有学者采用丙酮酸改善心肌能量代谢[7]。Mantovani应用微透析技术发现，ECC缺血期间能量代谢(葡萄糖、丙酮酸)下调，再灌注期间逐渐恢复。目前代谢检测方法由血浆代谢物检测发展为微透析检测，近年来代谢组学的兴起为全面的代谢分析提供了新思路[6，8]，因此本研究采用GC-MS全面反映ECC心肌代谢变化特点。本研究OPLS-DA分析发现经HTK液灌注后缺血期间心肌代谢改变不显著，再灌注期间代谢发生显著差异，KEGG代谢通路分析发现，ECC再灌注早期氨基酸代谢、核甘酸代谢及不饱和脂胞酸代谢明显上调，但同时参与了氧化应激的氨基酸、不饱和脂肪酸、黄嘌呤系统均上调，与腺苷相关代谢产物及琥珀酸等能量代谢物明显下调。
与缺血期相比，心肌再灌注后氨基酸代谢产物明显增加，可能与ECC期间能量代谢物相对缺乏、促进白质分解有关。既往研究发现在缺血等病理状态下，心肌代谢重构，氨基酸可作为能量底物的直接来源，参与葡萄糖代谢酶的活性，同时氨基酸摄取增加以抵消氧利用率降低对细胞的有害影响[9]，本实验中采用HTK液及低温进行心肌保护，未检测到缺血期间氨基酸代谢显著下调，表明缺血期间HTK液、低温等因素可能具有较好心肌保护效果。此外，氨基酸可改善氧化应激，抵消氧自由基的作用，氧自由基是谷胱甘肽合成的前体，或一氧化氮生物合成的底物[9]，其中丝氨酸、甘氨酸、脯氨酸、苏氨酸被证实参与氧化应激，再灌注期间显著增加，参与抗氧化应激的谷氨酰胺明显下降，与既往研究一致，因此改善ECC再灌注期间心肌保护可能仍需进一步降低氧化应激损伤。
核苷酸代谢与心肌能量代谢、氧自由基的产生密切相关，其中黄嘌呤氧化酶系统是参与心肌IRI机制中的氧自由基主要来源[10]。缺血期间ATP分解，产生大量次黄嘌呤和黄嘌呤，再灌注血供和氧供的恢复促进黄嘌呤氧化酶生成尿酸，同时释放大量O2-产生氧化应激损伤[11]，本研究中再灌注期间次黄嘌呤、尿酸、黄嘌呤核苷显著上调，推测氧自由基——论文作者：邹丽华，刘晋萍
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