本篇文章是由《中国临床医生》发表的一篇医学论文，(月刊)创刊于1972年，是中华人民共和国卫生部主管、人民卫生出版社主办的国家级医药卫生专业期刊，是华东地区优秀期刊，国家新闻出版总署“中国期刊方阵”期刊。
【摘要】 目的： 研究积雪草酸(asiatic acid，AA)对人肝癌细胞株(HepG2)的抑制作用，并探讨其与线粒体之间的关系。方法： 采用MTT法检测AA对HepG2细胞增殖的影响，倒置显微镜观察细胞形态的变化;荧光探针MitoTracker检测线粒体数目;荧光探针JC?1检测线粒体膜电位;荧光探针DCFH?DA检测胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量;ATP试剂盒检测胞内ATP水平;RT?PCR和Western Blot法分析电压依赖性阴离子通道(voltage?dependent anion channel，VDAC)表达量的变化。结果： AA能够剂量依赖性抑制肿瘤细胞株的增殖，30 μmol/L AA作用细胞24 h后细胞突起消失、胞体皱缩、变圆。AA能够使HepG2细胞线粒体膜电位下降，胞内ROS含量增加，降低胞内ATP水平，50 μmol/L AA能够增加VDAC蛋白的表达量。结论： AA抑制肿瘤细胞增殖的作用与线粒体有关，线粒体VDAC参与人肝癌细胞凋亡的调控过程。
【关键词】 积雪草酸; 线粒体; 电压依赖性阴离子通道; 肝癌细胞株
肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，死亡率高。抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡，是抗肿瘤药物作用的共同机制。线粒体在细胞死亡调控中发挥重要的作用，已成为癌症化学疗法的靶点[1]，通过线粒体途径诱发肿瘤细胞凋亡，是目前抗肿瘤药研发的重要方向之一。
积雪草酸(asiatic acid, AA),又名亚细亚酸,是我国传统中药积雪草的五环三萜类组分之一。经研究证明, AA具有对抗CCl4和D?GalN诱导的肝损伤[2, 3]、减弱化疗药物抗肿瘤的不良反应[4]、对抗神经细胞的氧化损伤[5]等作用。另外,也发现AA具有抑制黑色素瘤细胞增殖[6]、诱导直肠癌细胞凋亡的作用[7]。本研究探讨了AA对肝癌细胞株HepG2增殖的抑制作用及其与线粒体之间的关系。
1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 实验材料
HepG2(人肝癌细胞株)由南京大学徐力致老师惠赠。 AA(Sigma 公司产品，美国);MEM培养基(Gibco 公司产品，美国);0.25%胰蛋白酶(Amresco 公司产品，美国);胎牛血清(杭州四季青生物工程公司产品);MitoTracker Red FM(Invitrigen公司，美国);JC?1(Molecular Probes 公司，美国);MTT(Amresco 公司产品，美国);鼠抗人β?肌动蛋白单克隆抗体(Abcam公司，美国);鼠抗人VDAC抗体(Abcam公司，美国);羊抗小鼠 IgG?HRP(horseradish peroxidase)(武汉博士德生物工程有限公司);ECL 超级发光液(碧云天生物工程公司);考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒(南京建成生物工程研究所);其余未特殊注明的试剂均为进口或国产分析纯。
1.1.2 主要仪器
Spectra Max 190酶标仪(Molecular device，美国);Spectra MaxGemini荧光酶标仪(Molecular device，美国);核酸蛋白分析仪(岛津公司，日本);Bio?Rad电泳仪(Bio?Rad，美国);TE2000荧光显微镜(尼康公司，日本)。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养
HepG2细胞用含10%小牛血清的MEM培养基培养。将细胞接种于培养瓶中， 置于37 ℃、5% CO2，饱和湿度的孵箱中培养，2～3 d传代1次。
1.2.2 MTT法测细胞存活率
4×104 ml-1细胞100 μl 接种于96孔细胞培养板中培养24 h，加不同浓度AA处理24 h，弃去培养基，每孔加100 μl MTT(D?hank′s液溶解，浓度为1 g/L)，37 ℃继续孵育4 h后，吸去培养液，每孔加DMSO 100 μl，待结晶物充分溶解，1 h后用酶标仪于570 nm处测光密度。结果用抑制率表示，计算公式如下：
抑制率=对照组平均D570-给药组平均D570对照组平均D570-空白组平均D570×100%
1.2.3 MitoTracker染色检测线粒体数目
HepG2细胞经10，30，50 μmol/L AA处理24 h 后，用MitoTracker探针检测线粒体数目的变化，吸去培养孔中的培养基，加入37℃预温的含100 nmol/L MitoTracker的培养基100 μl，37℃孵育30 min。PBS洗2次，荧光酶标仪检测荧光强度(Ex588 nm/Em644 nm)。
1.2.4 JC?1染色测线粒体膜电位
4×103个HepG2细胞接种于 96 孔培养板中，以不同浓度AA作用于HepG2细胞24 h后，吸掉培养基,加入2.5 μg/ml的JC?1染料，37 ℃下避光孵育10 min，PBS洗2次，荧光酶标仪检测荧光强度(Ex488 nm/Em525，590 nm)。
1.2.5 ATP检测试剂盒测定胞内ATP水平
1.5×104个HepG2细胞接种于6 孔培养板中，以不同浓度AA作用24 h后，吸掉培养基，每孔加入200 μl裂解液裂解细胞。加100 μl ATP检测试剂到检测孔内，室温放置3～5 min后，再在检测孔内加上100 μl裂解细胞样品，迅速用枪混匀，间隔2 s后，立即用化学发光酶标仪测定荧光强度。
1.2.6 DCFH?DA探针法检测胞内ROS含量
4×104 ml-1 HepG2细胞培养24 h，经不同浓度的AA处理24 h后，加入无血清培养基稀释的DCFH?DA溶液，使其终浓度为10 μmol/L，37 ℃下负载探针30 min，PBS洗2次。用荧光酶标仪检测荧光强度(Ex488 nm/Em525 nm)，同时用荧光显微镜观察细胞的形态及荧光。
1.2.7 肝癌细胞VDAC基因检测
1.2.7.1 mRNA水平
反转录采用Invitrogen公司试剂盒说明书所述步骤;聚合酶链式反应(PCR)扩增反应体系：2.5 μl 10×缓冲液，1 μl dNTP，2 μl MgCl2，0.5 μl Taq DNA聚合酶，1 μl cDNA模板，1 μl 引物(VDAC)?A，1 μl 引物(VDAC)?S，1 μl 引物(β?肌动蛋白)?A，1 μl 引物(β?肌动蛋白)?S，13 μl 无菌水;引物序列为引物(VDAC)?S：5′?AGTGTGACGTTGACATCCGTA?3′，引物(VDAC)?A：5′ ?GCCAGAGCAGTAATCTCCTTCT?3′;引物(β?肌动蛋白?S: 5′?GGCTACGGCTTTGGCTTAAT?3′，引物(β?肌动蛋白)?A: 5′?CCCTCTTGTACCCTGTCTTGA?3′。反应先经过95 ℃ 2 min，然后是28个循环：94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，最后于72 ℃延伸反应4 min。PCR产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.7.2 蛋白水平
采用蛋白质印迹法检测。提取各组细胞总蛋白，进行蛋白定量后，样品按比例加入3× SDS凝胶上样缓冲液溶解，煮沸5 min。以20 μg蛋白进行上样，电泳。50 V恒压4 h将蛋白转至PVDF膜;封闭液(1 g脱脂奶粉，0.2 g BSA溶于20 ml PBST溶液)封闭1 h;一抗孵育(抗VDAC抗体1∶2000;抗β?肌动蛋白抗体1∶5000)4 ℃过夜;PBST清洗5次，每次10 min;二抗孵育(1∶3000)，室温1 h;PBST清洗5次，每次10 min;ECL发光液发光，暗室内X光片感光、显影、定影、观察。
1.2.8 统计方法
数据资料以±s表示，用SAS软件进行单因素方差分析(one way analysis of variance, ANOVA)，组间比较进行q检查，显著性标准为α=0.05，所有实验重复3次。
2 结 果
2.1 AA抑制肿瘤细胞增殖
如图1所示，HepG2细胞经终浓度分别为20，30，40 μmol/L的AA溶液处理后，细胞生长受到抑制，细胞形态改变，如突起消失，胞体皱缩变圆等。
由图2 MTT结果发现, 与对照组比较，低浓度AA(20 μmol/L)组对HepG2细胞的生长没有明显影响;当剂量达到40 μmol/L 时，AA对HepG2细胞增殖有显著抑制作用，抑制率达78%，由此AA在HepG2细胞株上的IC50值为27 μmol/L。
2.2 AA对HepG2 细胞线粒体数量的影响
结果如图3所示，与对照组比较，10 μmol/L AA组细胞荧光强度增加了11%，30 μmol/L AA组细胞荧光强度增加了146%，50 μmol/L AA 组细胞荧光强度减少了44%，即线粒体数量随着AA浓度的升高，有一个先升高后降低的过程。
2.3 AA对HepG2细胞线粒体膜电位的影响
HepG2细胞经不同浓度AA处理24 h后，加JC?1荧光探针检测线粒体膜电位的变化，结果见图4。从图4b荧光照片可见：对照组线粒体全为红色，说明膜电位较高;经20 μmol/L 解耦联剂CCCP处理2 h只见绿色荧光，膜电位降低;经40 μmol/L AA处理24 h后的HepG2细胞线粒体呈草绿色或橙黄色荧光，说明线粒体膜电位发生不同程度地垮陷，线粒体功能受到影响。从图4a红/绿荧光强度比值分析直方图可知 30，40 μmol/L AA极显著地降低了HepG2细胞线粒体的膜电位。
2.4 AA对HepG2细胞线粒体功能的影响
由图5可知，与对照组比，HepG2细胞经不同浓度AA处理24 h后胞内ATP水平呈剂量依赖性地降低。胞内ROS含量呈剂量依赖性升高。
2.5 AA对HepG2细胞线粒体VDAC蛋白表达的影响
由图6a可看出，与对照组相比， 10，30，50 μmol/L AA对VDAC转录水平基本无影响，仅30 μmol/L AA处理组VDAC mRNA转录水平略有降低。由图6b可知以对照组VDAC与内参β?肌动蛋白免疫条带灰度扫描的比值为100%，则10，30，50 μmol/L AA组分别为97%，187%，397%，说明AA 剂量依赖性地上调了VDAC蛋白的水平。
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