摘要半胱氨酸巯基上的氧化还原修饰能够可逆、可控地调节蛋白质活性、互作与定位,进而实现对诸多生物学进程与信号通路的精细调控.在蛋白质组层面上分析此类修饰位点及其动态转换有助于系统描绘并解析氧化还原调控网络.近年来,随着化学选择性标记试剂的不断涌现,质谱技术的升级换代,氧化还原修饰组分析的覆盖度与通量均得以极大提升,为氧化还原生物学研究提供了有力的研究工具与丰富的数据资源.本文从技术发展的角度,评述了目前常用的氧还蛋白质组技术类型及其优缺点、应用场景,介绍了此类数据驱动的若干科学发现,展望了未来拟突破与待拓展的方向.
关键词氧化还原,蛋白质组,半胱氨酸,质谱,化学探针
氧化-还原是指化学反应前后,元素的氧化态有变化的一类反应.在主要的生命构成元素当中,硫(sulfur)具有多个氧化态(从−2到+6),故其极易参与氧化还原反应.半胱氨酸(cysteine,Cys)是一种构成蛋白质组的含硫氨基酸.硫元素赋予了半胱氨酸化学上的“可变性”与功能上的“可调节性”.根据Uniprot知识库[1],半胱氨酸形成了多达22%的蛋白质活性位点,尽管其在人类蛋白质组中分布的理论丰度仅为3.3%.在生物系统中,氧化与还原是蛋白质半胱氨酸功能调节的主要途径,其主要驱动力有两种.
其一是内源性代谢或外源性刺激产生的活性氧/氮/硫(reactiveoxygen/nitrogen/sulfurspecies,ROS/RNS/RSS),介导半胱氨酸上发生多种可逆修饰(或称氧化还原修饰)[2~4].限于篇幅,本文仅讨论由非自由基型ROS(如过氧化氢,H2O2)介导的氧化反应(图1).在该氧化信号分子的直接作用下,半胱氨酸残基侧链上的巯基(–SH)将首先被氧化为次磺酸(sulfenylation,–SOH),后者既参与形成分子内或分子间二硫键–SS–或谷胱甘肽化修饰–SSG,也能被进一步过氧化(peroxidation),生成亚磺酸修饰(sulfinylation,–SO2H)乃至磺酸修饰(sulfonylation,–SO3H).
其二是细胞中复杂多样的还原酶系统,介导上述修饰(除磺酸外)的还原(图1).例如,在大肠杆菌中,次磺酸修饰能被两种异构酶DsbG/C特异性还原[5].二硫键和谷胱甘肽化修饰则能分别被进化保守的硫氧还蛋白/硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin/thioredoxinreductase,Trx/TrxR)和谷氧还蛋白/谷胱甘肽还原酶(glutaredoxin/glutathionereductase,Grx/GR)还原[6].此外,生物系统中还存在一类ATP(adenosinetriphosphate)依赖的亚磺酸还原酶(sulfiredoxin,Srx),用于还原在化学上不可逆的亚磺酸修饰[7].
类似于其他重要翻译后修饰(如磷酸化、乙酰化、泛素化等),半胱氨酸氧化还原修饰能够可逆地调节蛋白质活性、互作与定位,进而实现对诸多生命活动的精细调控(表1).在生理条件下,半胱氨酸氧化还原维持着动态平衡,而这些平衡失调则与许多重大疾病(如癌症[19]、糖尿病[20]、神经退行性疾病[21]等)存在密切关联.为进一步系统研究半胱氨酸氧化还原修饰的生理、病理意义,有必要规模化测定其在关键生理活动或重大疾病发生、发展中的形成与变化.得益于快速发展的化学选择性标记技术以及日趋成熟的质谱分析方法,人们发展了种类繁多的氧化还原蛋白质组分析策略(redoxproteomics).鉴于近年来已有若干论文对这些策略进行全面综述[22~26],本文拟从实用的角度出发,讨论常用技术类型的选择及其驱动的科学发现,并展望该领域的未来研究方向.
1半胱氨酸氧化还原修饰组分析:技术与选择
无疑,“假设驱动”研究发现了一系列重要的氧化还原转换分子事件,并且揭示了它们在生理、病理背景下调控意义(表1).蛋白质组学技术则能以“数据驱动”模式,为人们提供观测半胱氨酸氧化还原转换的“广角镜”.在该类技术发展中,人们面临的首要难题即半胱氨酸氧化还原状态在化学上高度不稳定,在生物学上高度动态.因此,通常需采用化学策略来进行“捕获”与“富集”,最终利用质谱法进行定性、定量分析.本文主要介绍基于各类化学策略的氧化还原蛋白质组分析技术.
1.1如何鉴定蛋白质组上氧化敏感的半胱氨酸残基位点?
确定复杂蛋白质组上氧化敏感的半胱氨酸残基位点无疑是研究氧化还原调控机制的第一步.一种最为经典的策略即采用亲电性化学试剂(如碘乙酰胺/碘乙酸及其衍生物,图2A)对亲核性的蛋白质巯基进行标记,通过免疫印迹或质谱定量,比较氧化剂处理前后标记效率的变化,间接地判断目标蛋白质是否发生氧化(图2B).例如,Lee等人[33]曾以放射性14C碘乙酸(14Ciodoaceticacid,14CIA)为巯基标记/检测试剂,发现了半胱氨酸介导的酪氨酸磷酸酶PTP1B(tyrosine-proteinphosphatasenon-receptortype1)氧化还原调控机制.如赋予此类巯基反应性试剂“富集与定量”的功能性,便能在蛋白质组层面上,系统地发现氧化敏感的半胱氨酸残基位点.例如,人们利用商品化的功能化巯基标记试剂(包括基于亲和素富集、一级质谱定量的ICAT[27]和基于抗体富集、二级质谱定量的IodoTMT[28],图2A),发展了一系列氧化还原蛋白质组技术策略[34~36].然而,这些试剂结构复杂,空间位阻妨碍其与非表面半胱氨酸结合.此外,ICAT/IodoTMT标记蛋白/肽段的富集亦面临非特异性结合强、批间分析差异大等技术挑战.因此,人们需要不断发展具有简化结构的功能化巯基标记试剂与更高效的富集方法.
随着生物正交概念的出现与“点击化学”的发展[37],巯基标记的“工具箱”不断丰富.近10年来,“可点击”巯基标记探针(如IA或IPM,图2A)被广泛地用于分析小分子化合物(如H2O2或亲电性化合物)与巯基蛋白质组的互作[30,32,38~42].探针标记的巯基蛋白质组或其酶切肽段可经“点击化学”反应转化为“可富集、可切割”的生物素化肽段,富集后的修饰肽段能被酶切/光解等温和手段洗脱,并进行基于质谱的定性与定量分析(详见参考文献[32]).例如,本课题组[30,32]基于IPM探针,发展了一种巯基反应性定量技术,名为QTRP(quantitativethiolreactivityprofiling),仅在一次实验中即可定量测定数千蛋白质半胱氨酸残基的氧化敏感性.尽管这些定量化学蛋白质组技术在其开发者及其合作者实验室得到有效应用,但其实验流程仍较为繁琐.因此,vandeReest等人[43]发展了一种样品处理更为简单易行的氧化还原蛋白质组技术,即采用稳定同位素标记的碘乙酰胺试剂,无需富集,直接利用深度覆盖策略定量分析整个蛋白质组.然而,该策略需要大规模离线肽段分馏与较长的质谱采集时间(1~2天/样品),限制了其分析通量.
相关期刊推荐：《生命科学研究》(双月刊)创刊于1997年，主要刊登：国内外生命科学领域中的具有创造性的学术论文及少量反映国内外重大进展或热点问题的快讯或综述性文章。内容涵盖：生物化学与分子生物学、发育生物学、细胞生物学、生物技术、遗传学、植物学、动物学、微生物学、解剖学、生理学、基因工程、农业工程、病理学、毒理学、药理学、免疫学、基础医学等等。
通过上述策略,人们能系统地筛选出氧化敏感的半胱氨酸位点,然后研究氧化作用如何影响靶蛋白的生化功能与生物学效应.反之,人们亦可利用其他技术筛选出受氧化还原调控的蛋白质,再用上述策略研究是否存在半胱氨酸依赖的分子机制.例如,Pei等人[44]利用转录因子组富集技术[45],发现H2O2能上调关键节律调节因子CLOCK的体外活性,提示存在潜在氧化还原调控机制.随后,他们利用QTRP技术准确地鉴定到CLOCK蛋白上的氧化敏感位点Cys195,后续功能研究表明,该位点突变能模拟敲低clock基因所造成的节律失调.
1.2如何区分蛋白质半胱氨酸上的特定氧化还原修饰类型?
上述策略极大地拓展了各类物种蛋白质组上的氧化敏感半胱氨酸位点,但其主要局限性在于无法区分氧化敏感位点上的具体修饰类型.不同类型氧化还原修饰可能对蛋白质功能产生相反影响.例如,过氧化物酶PRDX2(peroxiredoxin2)活性半胱氨酸残基被H2O2氧化为次磺酸后,通过分子间二硫键的形式将氧化当量传递至下游转录因子STAT3(signaltransducerandactivatoroftranscription3)并抑制其转录活性,而亚磺酸修饰则终止该氧化信号传递途径[46].又如,H2O2可以通过次磺酸修饰激活许多受体型酪氨酸激酶(如表皮生长因子(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)),而其激酶活性却被亚磺酸修饰所抑制[47,48].因此,精准区分修饰类型有助于阐明氧化还原作用对于蛋白质功能的具体影响.鉴于此,人们发展了如下策略.
第一类为选择性还原策略(图3A),即首先封闭蛋白质组上所有还原型巯基,然后采用化学/酶学体系选择性地将可逆氧化型修饰还原为巯基,最后采用功能化巯基反应性试剂(如ICAT,iodoTMT,图2A)或固相载体(如树脂辅助捕获法(resin-assistedcapture,RAC))进行富集、鉴定和定量[50,53,54].该策略成败的关键在于:(ⅰ)还原型巯基能否被完全封闭?(ⅱ)是否存在高度专属的还原系统?一方面,常用烷基化试剂,如碘乙酰胺,即便是在高毫摩尔浓度下也难以实现100%的封闭效果,导致假阳性[55].此外,高浓度烷基化试剂也可能与氧化修饰发生反应,导致假阴性[56].另一方面,尽管选择性存疑,但抗坏血酸/亚砷酸盐仍被用于还原次磺酸修饰[57,58].相比于化学还原,酶学还原体系(如Grx/GR之于谷胱甘肽化修饰)无疑具有更高的专属性,但后者的底物选择性却能造成分析的偏性.因此,在此类策略的应用中,设置对照组是避免上述问题的常用办法[15,50].
第二类为化学选择性标记策略(图3B),即利用化学反应直接标记、富集并检测特定氧化修饰.早在20世纪70年代,Benitez和Allison[59]即发现,亲核性环己二酮试剂,如DMD能选择性地与蛋白质次磺酸共价结合(基于其硫元素两性中的弱亲电性,图4A).在前者基础上,人们发展了一系列次磺酸修饰检测试剂,包括抗体[60]、荧光素[61]、生物素(DCP-Biotin)[62]与“可点击”试剂(如DYn-2和DAz-2)[63](图4B).然而,该基团与次磺酸反应的效率限制了相关试剂在蛋白质组分析中的应用[64].例如,本课题组[65,66]曾将DYn-2(图4B)用于次磺酸修饰位点的鉴定,但在一次实验中需使用多达30~40mg的蛋白样品,极大地限制了该方法的应用场景.为此,本课题组[51]筛选了一系列环己二酮类似物,发现苯并噻嗪与次磺酸的反应速率为前者的150倍以上.基于该基团设计的“可点击”次磺酸探针BTD(图4C)极大地提高了该修饰的分析能力[67].例如,本课题组[68,69]将其应用于拟南芥细胞和线虫中,均鉴定了超过1000个次磺酸修饰位点.此外,人们还针对次磺酸硫元素两性中的弱亲核性,发展了一系列基于亲电性基团的探针,然而均未能用于在位点水平上分析的次磺酸修饰组[70~72].相比于层出不穷的次磺酸探针,针对其他氧化修饰类型的化学探针及其蛋白质组学应用则较少.例如,近期本课题组[52]针对亚磺酸硫元素的弱亲核性,筛选出一类亲电性偶氮化合物,后者能与亚磺酸形成稳定的磺胺键,而与高度亲核性的巯基形成可还原的次磺酰胺键.利用两者稳定性的差异,即可实现亚磺酸的选择性标记(图5A).在此基础上发展出一种名为DiaAlk的探针(图5B),使得选择性亚磺酸修饰组分析成为可能.
其他类型策略则相对“小众”,包括以下三种.(ⅰ)代谢标记策略,仅限于谷胱甘肽化修饰的分析[73~75],即在细胞中加入带有功能化基团的人工合成谷胱甘肽或其前体,利用自身代谢或谷胱甘肽合成系统在蛋白质组上引入功能化基团(如生物素或“可点击”官能团),作为内源性谷胱甘肽修饰的“替代”.通过富集和分析代谢标记探针修饰肽段,即可鉴定谷胱甘肽化修饰蛋白及其位点.(ⅱ)遗传探针策略,仅限于次磺酸修饰的分析[76],即通过遗传操作在细胞中表达突变型YAP1(Yes-associatedprotein1)蛋白,后者唯一的Cys598能通过二硫键形式“捕获“并鉴定次磺酸化蛋白质组.有趣的是,Wei等人[77]最近利用含有YAP1Cys598的七肽,制备了用于富集二硫键交联肽段的抗体,实现了位点水平上的鉴定.(ⅲ)离子交换分离策略,仅限于(亚)磺酸修饰的分析[78],即利用(亚)磺酸修饰肽段与正常肽段在酸性条件下解离能力的差异,实现前者的相对富集.
1.3如何测定氧化比例?
有一种普遍观点认为,翻译后修饰的比例与其功能性呈正相关,即只有当修饰比例较高时才能发挥对蛋白质功能的调控作用[79].为此,人们发展了多种定量蛋白质组技术,用于规模化地测定各种修饰的比例(如磷酸化[80]、乙酰化[81]、氧化[82]).其中,Jakob课题组[82]最先报道了一种基于ICAT的绝对氧化比例测定方法,名为OxICAT(图6).该方法利用带有稳定同位素标签的ICAT试剂,分别对还原剂处理前后的同一样品进行标记,富集后采用质谱定性、定量.该方法不仅得到广泛应用[82~85],而且在此基础上衍生出诸多变体[31,86~90].例如,Xiao等人[31]最近发展了一种基于亚磷酸基团的功能化巯基标记试剂CPT(图2A),结合二级质谱定量技术,系统分析了小鼠各主要器官蛋白质组的氧化修饰比例,构建了名为Oximouse的数据资源.该研究表明,与其他修饰类似,氧化比例同样偏低,平均水平小于20%.尽管氧化比例偏高(>20%)的位点能被富集于特定生物学通路或网络,但这并未否定比例偏低者的生物学意义.有趣的是,Su等人[54]发现,激酶Akt上Cys60的基础氧化比例仅为0.5%,在温和氧化应激条件下上调至1.25%,但仍然能对该蛋白质功能及其介导的生物学效应产生显著影响.绝大多数还原型半胱氨酸的作用可能更像是“缓冲区”或“蓄水池”,以防发生真正意义上的氧化损伤.因此,对于生理条件下的氧化还原调节而言,本文认为,巯基反应性或氧化还原修饰水平的相对变化更能反映其所蕴含的功能性.尽管如此,组学层面上绝对修饰比例的测定仍能为人们认识氧化修饰的序列/结构选择性提供重要线索(见下文).此外,鉴于临床上使用的共价抑制剂多用于靶向蛋白质的半胱氨酸(如表皮生长因子受体EGFR的Cys797、Bruton酪氨酸蛋白激酶BTK的Cys481),氧化比例数据对于判定药物敏感性或预测耐药亦有重要参考价值[91].——论文作者：杨靖
转载请注明来自：http://www.lunwencheng.com/lunwen/dzi/19829.html
