摘 要：通过2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法，探究5种热带林木种子生活力最佳染色条件。结果表明，影响5种热带林木种子染色的主要因素为预处理时间、染色温度与TTC浓度的互作效应、染色温度等。5种林木种子的最佳染色条件不同。榄仁树种子生活力指数较高，受试验条件的影响不大，可选取任意一组试验条件作为最佳染色条件。水黄皮种子的最佳染色条件为：染色温度35 ℃，TTC浓度1.0%，温水浸泡时间12 h。银合欢种子的最佳染色条件为：染色温度35 ℃， TTC浓度0.5%，热水浸泡时间96 h。见血封喉种子的最佳染色条件为：染色温度40 ℃，TTC浓度 1.0%，温水浸泡时间36 h。黄槿种子的最佳染色条件为：染色温度30 ℃，TTC浓度0.5 %，硫酸浸泡时间1 h。研究结果可为基于种子生活力筛选天然更新能力较强的海防林树种提供依据。
关键词：TTC染色法 ;种子生活力指数;热带林木种子
种子生活力是种子健壮情况的一个指标[1] ，生活力强度由亲本遗传性质决定，同时受各种环境条件因素的影响[2] 。生活力强的种子，发芽快，对环境的适应能力强;反之则发芽慢，甚至不出苗，对环境的适应能力差[1] 。种子生活力的测定方法主要有：幼苗生长测定法、抗冷试验测定法、加速老化测定法、电导率测定方法、腺苷三磷酸(ATP)测定法、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法等[3-14] 。TTC染色法是根据种子生化代谢的强弱，经脱氢还原反应，种子表现差异性红色特征，并通过染色的面积、部位来判断种子生活力和组织状况的方法，可在12～24 h获得测定结果。相比其他方法，TTC染色法具有结果准确可靠、不受种子休眠限制、操作简便、省时快速的特点，并且许多标准发芽与TTC染色法的对比试验表明，TTC染色法测定结果与标准发芽率一般很接近，因此，TTC染色法是最有希望代替发芽试验的种子活力测定方法[15] 。TTC染色法应用广泛，可作为种子质量检测和种子贸易中简便、快速、准确掌握种子生活力的方法[16-17] 。
TTC染色法在林业方面研究中的应用尚处于发展阶段。应叶青等探索了山玉兰、厚朴、黄山峦树3种阔叶树种子TTC测定条件，提出了种子预处理的最佳染色浓度和最佳染色时间[18-19] 。研究发现，不同处理方法、TTC 浓度和染色时间对枳椇种子生活力测定结果具有显著影响，其染色效果随着染色时间的延长或 TTC 浓度的升高而加深[20-22] 。另外，TTC浓度、染色温度和染色时间三者在生活力测定中存在一定的线性关系，对生活力均有极显著影响[23] 。
通过文献分析发现不同林木种子的最佳染色条件可能存在一定的差异。基于以上各种生活力测定方法的分析，本文采用TTC染色法探究5种热带林木种子染色的最佳染色温度、TTC浓度、预处理时间。目前国内对热带林木种子，特别是海防林木种子生活力染色条件的研究还很少见。本文选取的材料主要来源于海南岛海防林区域，属于热带林木种子，通过最佳染色条件的研究，可为基于种子生活力筛选天然更新能力较强的海防林树种的后续研究提供研究基础，对于海防林生态恢复与建设具有重要理论及实践意义。
1 材料与方法
1.1 材料
本试验是基于种子生活力筛选人工海防林树种的前期研究，试验树种选择遵循以下原则：(1)优先选择海南岛海岸带有自然分布的树种;(2)群落中天然更新良好或结实量较多的树种。按此原则选择试验树种是因为海岸带自然分布的种群具有较强的抗风性能和适应海岸带土壤贫瘠(沙质土)、保水性能差等恶劣生态条件的能力，其在天然群落中繁殖能力较强，有可能在木麻黄林中实现自然更新。同时，还选择了2种园林树木，以探究园林树种作为海防林树种的可能性。
基于以上原则，选择海岸带天然种群树种榄仁树(Terminalia catappa)、水黄皮(Pongamia pinnata)、黄槿(Hibiscus tiliaceus);近海岸带路旁绿化树种银合欢(Leucaena leucocephala);海口市海南师范大学龙昆南校区内的绿化植物见血封喉(Antiaris toxicaria)。银合欢结实量大，且天然更新能力强。见血封喉虽然生长在校园内，但在海南有天然种群分布，且结实量大，天然更新良好，抗风能力也较强。采集种子的母树情况详见
1.2 方法
1.2.1 TTC溶液的配制
称取1 g TTC粉末，放入烧杯中用蒸馏水溶解，再用100 mL容量瓶定容，配制成浓度为1%的TTC母液。其他浓度的TTC溶液可以通过稀释母液获得。
1.2.2 种子预处理
将采回来的种子去除外种皮，挑出腐烂失活的种子。榄仁树外种皮坚硬，需用锤子将榄仁树种子沿着侧缝砸开(注意掌握力度，以免破坏种仁)，然后将种仁从外种皮中取出。见血封喉种子取回后冲洗干净，晾干，然后用手压碎种子表面薄薄的种皮，取出种仁。
1.2.3 染色正交试验
采用3因素3水平的正交试验(见表2)，选用的正交表为L(9 34 )，其中影响染色的3个因素分别为染色温度、TTC浓度和预处理(温、热水/浓硫酸浸泡)时间，染色温度3个水平为30、35、40℃，TTC浓度3个水平为 0.5%、0.7%、1.0%，榄仁树、水黄皮和见血封喉种子温水浸泡时间3个水平为12、24、36 h(初始温度为50～ 60℃)，黄槿种子硫酸浸泡时间3个水平为1、2、3 h，银合欢种子热水浸泡时间3个水平为：72、96、120 h(热水初始温度为90℃)。
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每个正交试验均为9个处理，每个处理2个重复。榄仁树由于种子破壳困难，破壳后完好种子较少，每个处理为25粒种子，银合欢种子硬实率高，每个处理也为25粒种子，其它树种的每个处理为30粒种子。将预处理后的种仁放入培养皿，加入对应浓度的TTC溶液，然后放入相应温度的黑暗培养箱进行染色，每隔1h 观察一次，直至种仁染色不再变化。最后将种子从培养箱中取出，倒掉废液，剥开种子，用自来水冲洗种子。将种子放置在滤纸上，观察并记录染色的情况，计算种子生活力指数。
1.2.4 染色鉴定原则[30]
有生活力的种子分为以下两种情况：(1)胚芽和子叶均完全着色;(2)胚芽完全着色，子叶着色面积超过一半。无生活力的种子分为以下几种情况：(1)胚芽完全着色，子叶着色面积小于一半;(2)胚芽没有完全着色，子叶完全着色;(3)胚芽和子叶均没有完全着色。
1.2.5 种子生活力指数计算
种子生活力指数是指一批种子中具有生命力的种子数占种子总数的百分比，表明种子发芽的潜在能力和种胚所具有的生命力[13] 。
种子生活力指数=(有生活力的种子数量/试验种子总数)×100%
2 结果与分析
2.1 榄仁树种子的生活力指数
在正交试验中，所有试验处理组的榄仁树种子全部为有生活力的种子，胚芽和子叶全部染色，种子生活力平均指数为100%。各试验处理条件下，榄仁树种子的生活力指数相同。
2.2 水黄皮种子的生活力指数及最佳染色
条件由表3可知，处理组6的水黄皮种子平均生活力指数最高，为85%;处理组4的水黄皮种子平均生活力指数最低，为51.67%;在不同处理组中，子叶未染色的水黄皮种子占13.33%～46.66%。极差分析表明，影响水黄皮染色的主要因素依次为：温水浸泡时间、染色温度与TTC浓度互作效应、染色温度、TTC浓度。经过水平优选和组合优选，染色温度取40 ℃，TTC浓度取0.5%或1.0%，温水浸泡时间取12 h。但考虑到染色温度与 TTC浓度互作对染色结果影响较大，经二者互作效应比较得知，染色温度为35 ℃，TTC浓度为1.0%时，种子生活力指数最高为85%，因此水黄皮种子的最佳染色条件为：染色温度35 ℃，TTC浓度1.0%，浸泡时间12 h，即处理组6为水黄皮种子最佳染色条件。
2.3 黄槿种子的生活力指数及最佳染色条件
由表4可知，处理组1的黄槿种子平均生活力指数最高为80%;处理组3、4、5和7的黄槿种子平均生活力指数不到55%，其中处理组3的平均生活力指数最低，仅为28.34%;在不同处理组中，胚芽未染色的占 8.33%～50%，胚芽和子叶均未染色的占8.33%～23.34%。极差分析表明，影响黄槿种子染色的主要因素依次为：硫酸浸泡时间、染色温度与TTC浓度互作效应、染色温度、TTC浓度。经水平优选和组合优选，并考虑互作效应，黄槿种子的最佳染色条件为：染色温度30 ℃，TTC浓度0.5%，硫酸处理时间1 h，即试验处理1的组合。
2.4 银合欢种子的生活力指数及最佳染色条件
由表5可知，处理组4、6、8的银合欢种子平均生活力指数最高，均为96%;处理组3的银合欢种子平均生活力指数最低，为50%;在不同处理组中，胚芽未染色的种子最高达36%，胚芽和子叶均未染色的种子最高达14%。极差分析表明，影响银合欢染色的主要因素依次为：热水浸泡时间、染色温度、染色温度与TTC浓度互作效应、TTC浓度。经水平优选和组合优选，并考虑互作效应，银合欢种子的最佳染色条件为：染色温度 35 ℃，TTC浓度0.5%，浸泡时间96 h，即试验处理组合4。
2.5 见血封喉种子的生活力指数及最佳染色条件
由表6可知，处理组9的见血封喉种子平均生活力指数最高，为80%;处理组1的见血封喉种子平均生活力指数最低，为41.67%;在不同处理组中，子叶未染色的比例为11.67%～28.33%，胚芽和子叶均未染色的比例为6.66%～26.66%。极差分析表明，影响见血封喉染色的主要因素依次为：TTC浓度、温水浸泡时间、染色温度、染色温度与TTC浓度互作效应。水平优选和组合优选结果为染色温度为40 ℃，TTC浓度为1.0%，温水浸泡时间为36 h。由于互作效应较小，因此见血封喉种子的最佳染色条件为水平选优结果，最佳染色条件未出现在试验处理组合之中。
3 结论与讨论
种子的生活力反映了种子发芽的潜在能力，是判断种子质量的重要指标[24] 。最佳染色条件下，5种热带林木种子的生活力指数均不低于80%，其中榄仁树和银合欢的生活力指数较高，分别为100%和96%，说明这些热带林木种子的质量较好。石磊、张瑜等人的研究表明，厚朴、木豆种子的生活力指数最高也可达 100%和93%[23，25] 。于淑兰等人的研究表明，23种试验树种中，银合欢种子的生活力指数为35%[26] ，与本研究结果相差较大，其原因有待进一步探究。非最佳染色条件下，影响不同林木种子染色结果的种子部位有所不同，影响水黄皮种子染色的主要是子叶，影响黄槿种子染色的主要是胚芽及子叶+胚芽，影响银合欢种子染色的主要是胚芽+子叶，影响见血封喉种子染色的主要是子叶+胚芽。
影响不同热带林木种子染色的主要因素有所不同。影响水黄皮和黄槿2种半红树植物的主要因素是温水或硫酸的浸泡时间及染色温度与TTC浓度互作效应，影响银合欢的主要因素是热水浸泡时间和染色温度，影响见血封喉的主要因素是TTC浓度和温水浸泡时间。结果表明，对于所有5种热带林木，种子预处理时间均为主要因素;除了见血封喉，TTC浓度均为非主要因素，这与石磊等人的研究结果相一致[25] 。不同因素的互作效应虽然未见报道，但不同林木种子染色的主要影响因素是有差异的，如影响小叶黑柴胡种子染色的关键因素是染色温度、TTC 浓度、染色时间[27] ，影响枳椇种子染色的关键因素是TTC 浓度和染色时间[20] 。
不同热带林木种子的最佳染色条件不尽相同。所有处理组榄仁树种子的生活力指数均为100%，表明新鲜的榄仁树种子生活力很高，实验中不受染色条件的影响。水黄皮种子的最佳染色条件为染色温度 35 ℃，TTC浓度1.0%，温水浸泡时间12 h。黄槿种子的最佳染色条件为染色温度30 ℃，TTC浓度0.5%，硫酸浸泡时间1 h。银合欢种子的最佳染色条件为染色温度35 ℃，TTC浓度0.5%，热水浸泡时间96 h。见血封喉种子的最佳染色条件为染色温度40 ℃，TTC浓度1.0%，温水浸泡时间36 h。研究结果表明，虽然染色温度及 TTC浓度应控制在30～40 ℃和0.5%～1.0%范围比较理想[5-6] ，但此范围内染色条件的处理组合对种子染色结果的影响仍然是较大的，因此不同热带林木种子需要筛选出不同的最佳染色条件。染色条件不仅影响染色效果，也影响染色时间的长短。染色温度越高，TTC浓度越大，染色速度越快，但是温度过高，浓度过大会导致种子表面及子叶中间产生大量絮状衍生物，影响活力鉴定的准确性。
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