摘要为揭示毛竹入侵邻域林分过程中对土壤细菌群落多样性变化的影响，以马尾松林为研究对象，采集纯毛竹林、竹针混交林和常绿针叶(马尾松)混交林3类样地的混合土样，基于高通量测序技术分析土壤细菌群落多样性和结构变化.结果表明:研究期间共得到细菌类群39门88纲134目160科511属;在门的分类水平上，与竹针混交林、常绿针叶混交林相比，纯毛竹林酸杆菌门所占比例显著较低，而放线菌门、拟杆菌门、TM7和衣原体门所占比例较高;在属的分类水平上，相对于纯毛竹林，竹针混交林和常绿针叶混交林均有多属表现出所占比例显著上升或下降，单独出现在竹针混交林或常绿针叶混交林且所占比例在0.005%～0.1%的非优势属有130属;α多样性指数均表现为常绿针叶混交林>竹针混交林>纯竹林，且纯竹林与两者均有显著差异，而常绿针叶混交林和竹针混交林之间差异不显著.PCoA分析表明，毛竹入侵对土壤细菌的种群多样性和群落结构产生了影响;所占比例小于0.1%的非优势菌群门分类水平的百分比特征与土壤环境梯度(水溶性有机氮和硝态氮)之间有显著相关性，两者对毛竹入侵马尾松林后土壤细菌群落的非优势种群影响巨大，具有重要的参考价值.
关键词针叶林;竹针混交林;常绿-针叶混交林;土壤环境;多样性;高通量测序
竹类植物在全球许多国家的农林生态系统中占有重要地位，常被作为食物、建筑材料、纤维生产原料以及生物能利用材料等[1].毛竹(Phyllostachysedulis)是我国最主要的笋材两用竹种，用途广泛，20世纪70年代已在黄河中下游流域和南方诸多省份规模化推广.目前，我国竹林面积约6.01×106hm2，其中毛竹林占70%以上[2].尽管毛竹人工林带来了巨大的经济效益，但其并不具备天然林所具有的生态效益.毛竹林是一个典型的由大型克隆种群构成的开放生态系统，对人为和自然的干扰极为敏感，其在结构、功能和系统发育过程上均表现出一定的缺陷[3].研究表明，随着毛竹林经营强度的加大，以丧失大量壳斗科、樟科和松科等乔木树种为代价的毛竹纯林化过程，从根本上破坏了自然生态系统的结构稳定性[3-5]，并且其成功入侵其他林分后演变为毛竹单优群落，使生态系统整体恶化的危险性上升[3].
毛竹入侵天然林后，植被的生物多样性显著下降[4-5]，但对地下生态系统如何响应毛竹的入侵仍知之甚少[6].土壤微生物是生态系统中最活跃的生态因子之一，对分解土壤有机质、同化无机养分、驱动和参与生态系统养分循环具有关键作用[7-8].同时，采用传统实验室微生物分离培养方法难以全面反映土壤微生物群落结构的实际情况[2，9].本试验以毛竹入侵马尾松(Pinusmassoniana)林为研究对象，基于16SrDNAV3/4区片段的IlluminaMiseq高通量测序技术和生物信息学分析土壤细菌群落变化，探讨毛竹入侵邻域对土壤细菌结构和群落多样性的影响，为揭示毛竹入侵邻域林分对土壤细菌群落生态稳定性的影响，评价毛竹入侵邻域林分对地下生态系统的影响提供技术支撑和数据参考.
1研究区域与研究方法
1.1研究区概况
试验样地位于浙江省长兴县小浦镇葡萄岕(30°58'N，119°45'E)，属亚热带海洋性季风气候.年平均气温(15.6±0.5)℃，有效积温5750℃，无霜期239d.年平均降水量1309mm.年平均日照时数1810.3h，历年平均日照百分率为41%，光照分配较均匀.土壤以发育于酸性岩浆岩的红壤为主.样地海拔111～187m，坡度5°～20°，坡向NE5°，土层深厚，在1.0m以上.土壤有机质平均含量为30.2g·kg-1，全氮含量0.66～2.45g·kg-1，有效磷含量62.01～132.40mg·kg-1，速效钾含量30.11～116.20mg·kg-1.
1.2研究方法
沿毛竹入侵马尾松林的水平方向依次设置10m×10m的样方，设纯毛竹林、竹针混交林、常绿针叶混交林3个样方区.纯毛竹林分布于海拔111～145m，郁闭度50%.灌木以三花悬钩子(Rubustrianthus)、山橿(Linderareflexa)、映山红(Rhododendronsimsii)、茶荚蒾(Viburnumsetigerum)和大青(Clerodendrumcyrtophyllum)为主.1982年，马尾松林抚育5年后自然生长17年，全伐，2003年，毛竹林抚育7年后自然生长8年，有择伐.竹针混交林分布于海拔145～164m，坡向NE5°，郁闭度45%.其中马尾松处于主冠层，毛竹居于次层，林下灌木以檵木(Loropetalumchinense)、山橿、山鸡椒(Litseacubeba)、毛八角枫(Alangiumkurzii)和野鸭椿(Euscaphisjaponica)为主.1982年，马尾松林抚育5年后自然生长17年，有择伐，后在毛竹与马尾松的边界层每年向马尾松林方向林下抚育，连续7年，后处于自然状态.常绿针叶混交林分布于海拔164～187m，郁闭度60%.冠层以马尾松为主，亚乔层以檵木和山鸡椒为主，灌木层主要是山橿、高粱泡(R.lambertianus)、野鸦椿、隔药柃(Euryamuricata)和映山红.1982年，马尾松林抚育5年后自然生长26年，有择伐.
在每个样区的上坡、上中、中坡、中下和下坡位形成5个样方，在每个样方中沿对角线每隔2～3m随机用土钻采集5个点的0～20cm土壤(去除表层凋落物和杂质)，样方内的土样混合均匀、去除根和石头，放置-18℃低温采样箱内.所有土壤样品均分为2份:一份6h内带回实验室保存于-78℃超低温冰箱，用于DNA提取和高通量测序;另一份自然风干后用于土壤理化参数测定.
1.3DNA提取、PCR和IlluminaHiseq测序
DNA提取采用TIANampStoolDNA试剂盒.对微生物基因组16SrDNAV3/4高变区进行扩增，引物为:上游引物F:5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3';下游引物R:5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'.
PCR反应体系(25μL):12.5μL2xKAPA高保真热启动DNA聚合酶预混液(HiFiHotStartReadyMix)，1μL上游引物和下游引物，5.5μLPCR液和5μL模板.PCR反应条件:95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，反应25个循环，72℃5min;4℃保存.样本添加特异性标签序列采用以下PCR反应体系(50μL):25μL2xKAPA高保真热启动DNA聚合酶预混液，2μL公共引物，2μLbarcode引物，16μLPCR液和5μL稀释模板.PCR反应条件:95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，反应8个循环，72℃5min.每个样品的PCR产物割胶回收后用UVVisspectrophotometer(NanoDropND1000，USA)测量浓度.
文库构建和IlluminaHiSeq2500测序由上海祥音生物科技有限公司完成.
1.4数据处理
测序后的DNA序列采用PANDAseq进行拼接.拼接后的序列应用USEARCH除去嵌合体，然后用QIIME软件将所有样品序列整合.1个微生物可操作单元(OTU)为序列相似度大于97%的DNA序列.基于Greengenesv13_08数据库提取OTU以及进行种属分类.去掉小于占所有序列数目0.005%的OTU进行后续分析.用QIIME软件计算多样性指数.
通过SPSS11.0的最小显著差数法(LSD)对OTU数量进行多重比较分析(α=0.05);通过R语言软件包进行土壤细菌群落结构的主坐标分析(PCoA)和冗余分析(RDA).
2结果与分析
2.1基于高通量测序的细菌群落结构
纯毛竹林、竹针混交林和常绿针叶混交林样本最终测序结果占整个基因组的比例(即样本覆盖度)分别为(98.1±0.3)%、(97.7±0.3)%、(97.9±0.3)%，其值均>95%，能确保其测序结果代表样品的细菌组成.经高通量测序发现，上述3类样地细菌类群达到39门88纲134目160科511属，其中:纯毛竹林的细菌类群为36门79纲120目143科413属;竹针混交林的细菌类群为32门74纲112目120科367属;常绿针叶混交林的细菌类群为36门81纲117目123科412属.
2.1.1门的分类水平纯毛竹林样地细菌类群在门的分类水平上的优势类群(平均所占比例大于1%)分别为酸杆菌门(28.6±2.7)%、变形菌门(25.6±1.6)%、放线菌门(9.9±2.3)%、浮霉菌门(8.5±1.5)%、疣微菌门(4.3±0.6)%、拟杆菌门(4.1±1.4)%、TM7(3.3±0.3)%、绿弯菌门(2.9±0.7)%、WPS-2(1.9±1.0)%、衣原体门(1.8±0.7)%和AD3(1.4±0.3)%(图1).竹针混交林的优势类群分别为酸杆菌门(36.7±2.2)%、变形菌门(26.1±2.1)%、浮霉菌门(12.3±2.5)%、放线菌门(4.8±1.9)%、WPS-2(3.4±2.5)%、疣微菌门(3.0±1.2)%、绿弯菌门(2.7±0.8)%、TM7(1.8±0.9)%和拟杆菌门(1.4±1.3)%.常绿针叶混交林的优势类群分别为酸杆菌门(34.7±5.3)%、变形菌门(25.3±0.9)%、浮霉菌门(13.0±2.1)%、放线菌门(4.9±2.2)%、疣微菌门(4.3±1.7)%、WPS-2(2.7±1.3)%、TM7(2.4±0.7)%、绿弯菌门(2.0±0.8)%和拟杆菌门(2.0±1.5)%.纯毛竹林酸杆菌门所占比例显著小于竹针混交林、常绿针叶混交林，后两者差异不显著;纯竹林的放线菌门、拟杆菌门、TM7和衣原体门所占比例显著大于竹针混交林、常绿针叶混交林.
2.1.2属的分类水平在3块样地15个土壤样品的属分类水平上(>1.0%)(表1)，Ellin6513目未定属Ellin6513;f_;g_在3类样地中都大量存在(>10%)，且各样地之间无显著差异.与纯毛竹林样地相比，竹针混交林的CandidatusKoribacter、Koribacteraceae科未定属Koribacteraceae;g_、JG30-KFAS9目未定属JG30-KF-AS9;f_;g_、醋酸杆菌科未定属Acetobacteraceae;g_、Beijerinckiaceae未定属Beijerinckiaceae;g_、慢生根瘤菌科未定属Bradyrhizobiaceae;g_、甲基孢囊菌科未定属Methylocystaceae;g_和WPS-2门未定属WPS-2_;c_;o_;f_;g_所占的比例显著上升;而噬几丁质菌科未定属Chitinophagaceae;g_、鞘脂杆菌科未定属Sphingobacteriaceae;g_、CandidatusRhabdochlamydia、柄杆菌科未定属Caulobacteraceae;g_和Auto67_4W科未定属Auto67_4W;g_所占的比例显著下降.与纯毛竹林相比，常绿针叶混交林的酸杆菌科未定属Acidobacteriaceae;g_、酸微菌目未定属Acidimicrobiales;f_;g_、CandidatusRhabdochlamydia、Auto67_4W科未定属Auto67_4W;g_所占比例显著下降，而CandidatusKoribacter、CandidatusSolibacter、Koribacteraceae科未定属Koribacteraceae;g_、Beijerinckiaceae未定属Beijerinckiaceae;g_、慢生根瘤菌科未定属Bradyrhizobiaceae;g_、甲基孢囊菌科未定属Methylocystaceae;g_和WPS-2门未定属WPS-2_;c_;o_;f_;g_所占比例显著上升.这与竹针混交林有类似之处.而竹针混交林与常绿针叶混交林在属水平的比较，排除所占比例小于1.0%的属，仅有CandidatusKoribacter和JG30-KF-AS9目未定属JG30-KF-AS9;f_;g_2个属表现出显著差异(P<0.05).
2.2土壤细菌多样性指数
2.2.1α多样性种类复杂度本试验通过OTU数、测序深度指数、菌种丰富度指数(Chaol)、PD指数、Shannon指数和Simpson指数进行样本的α物种多样性分析.检测的OTU数为纯竹林<竹针混交林<常绿针叶混交林(图2)，纯竹林与后两者均有显著性差异，后两者之间差异不显著，说明纯竹林样地细菌群落在总体数量上处于弱势;测序深度指数表明纯竹林>竹针混交林>常绿针叶混交林，说明纯竹林只含一条序列的OTU数量少，特异性较后两者明显下降;菌种丰富度指数为纯竹林<竹针混交林<常绿针叶混交林，亦佐证了测序深度指数的结果，表明常绿针叶混交林的菌种组成较为丰富，纯竹林与后两者有显著差异;PD指数、Shannon指数和Simpson指数均表现为纯竹林最小，竹针混交林居中，常绿针叶混交林最大，表明纯竹林的谱系多样性、样地的细菌物种多样性和菌群均匀度最低，且与常绿针叶混交林有显著差异.
2.3土壤细菌群落的主坐标(PCoA)分析
PCoA是一种研究数据相似性或差异性的可视化方法.PC1、PC2和PC3维度分别解释了58.2%、13.6%和7.7%的土壤细菌群落OTU信息(图3)，供试的15个样方可划分成纯毛竹林、竹针混交林和常绿针叶混交林3部分.3种类型的土壤细菌群落组成均存在显著差异，说明土壤细菌群落结构的变化可能与植物群落变化有关，其中竹针混交林样方信息量与纯毛竹林有连续性，竹针混交林N9、N10样方与常绿针叶混交林N11、N13样方表现出一定的重叠性，较好地反映了3类样地取样时的实际情况，亦说明三者的土壤细菌群落结构组成具有连续性，且每一类型样地内部样方的细菌群落结构较为接近;而纯毛竹林与常绿针叶混交林样地的距离较远，说明两者的土壤细菌结构有较大差异.
3讨论
不同植被群落由于地下根系分泌物和地表凋落物的不同，其输入的碳源种类亦不同[10]，故植被群落的生长发育对土壤结构和营养状况产生影响，直接导致土壤微生物群落结构特征发生变化[11-13].有研究发现，毛竹入侵阔叶林后，毛竹林与阔叶林土壤细菌的相似性大于其与过渡的竹阔混交林土壤细菌的相似性，并认为是土壤菌群对输入碳源的不适应或者是对原来残留的阔叶林碳源的响应[6].本研究发现，在门的分类水平上，纯毛竹林的酸杆菌门所占比例较竹针混交林和常绿针叶混交林显著下降，但纯竹林的放线菌门、拟杆菌门、TM7和衣原体门所占比例显著高于竹针混交林和常绿针叶混交林，而后两者变化不大;在属的分类水平上，竹针混交林和常绿针叶混交林均有多属表现出所占比例显著上升或下降;同时，α多样性指数均表现为纯竹林最小，竹针混交林居中，常绿针叶混交林最大，前者与后两者均有显著差异，而后两者之间差异不显著.这可能与毛竹林栽种前初始环境、植被本底条件和栽种时间有关.赵天心等[5]和何冬华等[14]对土壤细菌、真菌和固氮细菌的研究发现，马尾松林改种毛竹林后短期内土壤微生物群落结构均发生明显变化，但随着毛竹种植时间的增加，其群落结构出现恢复种植毛竹之前状态的趋势.本研究的毛竹林从2001年开始种植，到2017年已有16年，尚未发现微生物抵抗外界干扰、恢复到初始状态的特殊功能.这可能与毛竹自然生长和土壤菌群恢复的年限有关，即天然马尾松林改种毛竹短期(5年)内微生物量和多样性下降，而随着栽种时间逐渐恢复，至25年时逐渐恢复到改造前水平[15].也有研究认为，毛竹样地和土层的选择对土壤细菌多样性的影响明显大于种植时间[5].因此，本文认同毛竹入侵马尾松林对土壤微生物种群结构组成和多样性具有影响，但受研究尺度[16]、区域植被[10-13]、土壤和微环境[8]的相互作用和制约，各因素对土壤菌群的影响机制和效应结果并不一致.
毛竹入侵马尾松林的土壤菌群多样性变化相关期刊推荐：《应用生态学报》(月刊)是中国科学院主管、中国生态学学会和中国科学院沈阳应用生态研究所联合主办的综合性学术期刊，创刊于1990年，由科学出版社出版。本刊主要报道应用生态学领域的创新性科研成果与科研进展，反映我国应用生态学的学术水平和发展方向，跟踪学科发展前沿，注重理论与应用结合，促进国内外学术交流合作与人才培养。有投稿需求的作者，可以直接与在线编辑联系。
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