摘 要 以苹果连作障碍病原真菌层出镰刀菌、串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌为靶标菌，通过平板对峙法对分离自苹果根际土壤的细菌进行反复筛选比较，对筛选出的拮抗效果最优的菌株进行形态学、生理生化特征和 16S rDNA 序列分析鉴定，并于盆栽条件下探讨其菌肥对平邑甜茶幼苗生长及连作土壤环境的影响.结果表明: 菌株 B6 对上述 4 种病原真菌的抑菌率最高，分别达到 71.8%、70.1%、72.6%、91.5%.经鉴定，菌株 B6 为甲基营养型芽孢杆菌.盆栽试验表明，与连作处理( CK1 ) 相比，B6 菌肥处理( T) 可以不同程度地促进平邑甜茶幼苗生物量的增加，其中地径、鲜质量和干质量分别显著增加 18.3%、51.2%; 显著提高连作土壤中可培养细菌和放线菌数量，使真菌数量下降为连作土壤的37.7%，促使土壤类型向细菌型转化; 显著提高连作土壤中的蔗糖酶、磷酸酶、脲酶和过氧化氢酶的活性，增长率分别为37.3%、 24.0%、42.9%、49.4%.表明 B6 菌肥可以优化苹果连作障碍土壤中可培养微生物群落结构，提高土壤酶活性，增加平邑甜茶幼苗生物量.
关键词 甲基营养型芽孢杆菌; 镰刀菌; 生物防治; 土壤酶
苹果连作障碍广泛发生于世界各苹果主产区[1]，在果园重建过程中会使苹果根系数量减少、幼苗生长缓慢、结果能力下降、品质变劣、苹果病虫害加重，甚至导致树体直接死亡[2]，已经严重制约苹果产业的可持续发展.越来越多的研究表明，土传病虫 害，尤其是真菌中的柱孢属 ( Cylindrocarpon spp.) 、镰刀菌属( Fusarium spp.) 、丝核菌属( Rhizoctonia spp.) 和腐霉属( Pythium spp.) 等大量繁殖所引起的土传病害，是苹果连作障碍的主要原因[3-6].因此，找到适宜的控制土传病虫害的措施是有效防控苹果连作障碍的根本途径之一.在目前实际生产中，防控苹果连作障碍行之有效的措施主要有土壤消毒[7]、深翻土壤、轮作种植[8]等.但土壤消毒过程可能污染环境，影响健康[9]，深翻土壤成本较高且存在复发可能性，轮作种植耗费时间较长，实际生产中推广较为困难.因此，寻找可行、有效的替代措施成为国内外学者研究的热点，苹果连作障碍的生物防控措施就应运而生.
生物防控是指通过引入有益微生物来抑制土壤中病原菌的繁殖、生长或干扰病原菌对寄主植物侵染，从而达到控制植物病害的一种高效、环保的防控方法.焦永刚等[10]研究表明，施用微生物菌肥可以改良土壤生态环境，提高植物果实产量与品质，缓解土地连作 障 碍. 宋 海 富 等[11] 研 究 发 现，施 加 菌 肥 ND35( Chaetomium globosmn) 可以有效增加平邑甜茶幼苗生物量，提高主要土壤酶活性，在一定程度上减轻苹果连作障碍.张先富等[12]在平邑甜茶幼苗根部接种草酸青霉 A1( Penicillium oxalicum) 菌肥后发现，它可以抑制连作土壤中尖孢镰孢菌( Fusarium oxysporum) 的生长，增加平邑甜茶幼苗的生物量.苏春沦等[13]发现，将内生真菌拟点茎霉 B3( Phomopsis liquidambari) 和苍术( Atractylodes lancea) 粉复合处理也可以缓解连作障碍.目前，许多生防菌株在盆栽条件下都展现出了良好的防控连作障碍能力，但在苹果连作障碍生物防控领域，有关探究生防细菌于盆栽条件下对苹果连作障碍的防控效果的报道仍较少.因此，本试验以中国环渤海地区苹果连作障碍主要致病原真菌层出镰刀菌( Fusarium proliferatum) 、串珠 镰 刀 菌 ( Fusarium moniliforme) 、尖 孢 镰 刀 菌 ( Fusarium oxysporum) 和腐皮镰刀菌( Fusarium solani) [14]为靶标菌，从苹果根际土壤中筛选出具有高效拮抗效果的生防细菌，并在盆栽试验条件下探究其菌肥对苹果常用砧木平邑甜茶( Malus hupehensis) 幼苗生长状况及苹果连作土壤环境的影响，以期为苹果连作障碍的生物防控提供理论依据.
1 材料与方法
1. 1 材料
供试土壤取自山东省泰安市满庄镇小王庄村 25 年生的老龄苹果园，收集位于距树干 1 m、深 5 ～ 40 cm 区域内的土壤，作为实验用土.
供试菌株‘B6’于本实验分离自苹果根际土壤; 层出镰刀菌、串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌均由山东农业大学植物保护学院植物病理实验室提供.
供试培养基为 LB 培养基( 10 g 蛋白胨，5 g 酵母膏，10 g NaCl，1000 mL 水，pH 7.0; PDA 培养基: 200 g 马铃薯，20 g 葡萄糖，20 g 琼脂，1000 mL 水， pH 自然; 高氏一号培养基: 20 g 可溶性淀粉，2 g KNO3，0.5 g NaCl，0.5 g K2HPO4，0.5 g MgSO4，0.01 g FeSO4，琼脂 20 g，1000 mL 水，pH 7.2～7.4) .
供试植物为苹果常用砧木平邑甜茶.将其种子于 4 ℃ 层积 30 d 左右，待种子露白后，播种于育苗基质，幼苗长至 6 片真叶时，备用.
1. 2 生防菌株的分离与纯化
取采集到的苹果根际土壤 10 g，加入 90 mL 无菌水中，在 180 r·min-1 摇床上振荡 30 min 后用 9 mL 无菌水进行梯度稀释，取 10-5 、10-6 、10-7 稀释液 0.1 mL 涂布于 LB 平板，置于 37 ℃培养箱内培养 24 h 左右，挑取菌落形态差异明显的菌落，进行平板划线法纯化，选取单菌落备用.
1. 3 生防菌株的筛选
以纯化后的菌株为待检测菌，以病原菌层出镰刀菌、串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌为对峙菌，以不接种拮抗菌的 PDA 培养基为空白对照，采用平板对峙法[15]筛选出目的菌株.用打孔器在活化后的病原菌菌丝上打取菌饼( 直径 4 mm) ，并将之接种于 PDA 培养基中心，在距离菌饼 2.5 cm 处接种待测菌.28 ℃ 培养 5 ～ 7 d 后，对拮抗效果较好的生防菌进行复筛.复筛操作如上，重复 3 次，从中挑选抑菌活性最高的生防菌备用.抑菌活性采用抑菌率[16]表示，计算公式: 抑菌率 = ( 对照组平均菌落直径-试验组平均菌落直径) /( 对照组平均菌落直径-菌饼直径) ×100%，其中菌落直径采用十字交叉法测量.
1. 4 拮抗细菌鉴定
1. 4. 1 生理生化及形态鉴定 将具有较好拮抗效果的生防菌株接种于 LB 培养基上，37 ℃ 培养 24 h 后观察菌落并进行显微镜检，然后按照《常见细菌系统鉴定手册》[17]进行生理生化鉴定.
1. 4. 2 16S rDNA 分子生物学鉴定 利用细菌通用引物 27-F /1492-R 对 B6 基因组模板进行 16S rDNA 基因 PCR 扩增. 通用引物其正向序列为 27-F: 5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反 向 序 列 为 1492- R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'.
PCR 扩增条件: 95 ℃ 预变性 5 min，94 ℃ 变性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃ 延伸 60 s，30 个循环; 最后 72 ℃延伸 5 min.PCR 产物由青岛擎科梓熙生物技术有限公司测序，返回测序结果后于 NCBI 网站上的 GenBank 核酸数据库进行 Blast 比对，选用同源性 97%以上的序列利用软件 MEGA7.0 构建系统发育树进行同源性分析.
1. 5 盆栽试验
1. 5. 1 菌肥制备 采用固体发酵法制备菌肥，先将生防 菌 株 接 种 于 LB 液 体 培 养 基 中，37 ℃ 180 r·min-1 震荡培养 24 h，然后以 12.5%的量接种于含水率 50%的麸皮培养基中，采用浅盘发酵，37 ℃ 下培养 72 h 后，60 ℃干燥 12 h 制成.每克菌肥含菌芽孢量为 5×108 CFU.
1. 5. 2 盆栽试验 试验于 2017 年 4—12 月进行. 2017 年 4 月将长势基本一致的 6 叶平邑甜茶实生苗移栽于泥瓦盆( 直径 23 cm、高 18 cm) 中，每盆定植 3 棵，缓苗期过后间掉幼苗 1 棵.盆中土壤处理分别为: 苹果园连作土壤( CK1 ) 、溴甲烷熏蒸后的连作土壤( CK2 ) 、菌肥载体( 麸皮) 处理( CK3 ) 、B6 菌肥处理( T) ，每个处理各 20 盆，每盆装土 7 kg，其中菌肥载体以及菌肥添加量均为装土量的 1%.浇水采用滴灌方式，期间不再添加任何肥料.
1. 6 盆栽防控效果测定
1. 6. 1 取样 盆栽幼苗生长 90 d 后，取样测定相关指标.土壤样品采集: 同时取各个处理后的土壤样品，其中每个处理随机取 15 盆，过 2 mm 筛后等量混匀，分两部分保存: 一部分风干，用于土壤酶活的测定; 一部分带回实验室保存于 4 ℃冰箱，用于土壤中可培养微生物数量测定.植株样品采集: 植株样品整株采集，用清水将根部土壤冲洗干净，将之及时带回实验室，测定其株高、鲜质量等指标.
1. 6. 2 生物量测定 用游标卡尺和直尺分别测定平邑甜茶实生苗的地径和株高，用电子天平测定其干、鲜质量.随机测定每个处理的 3 株幼苗，重复 3 次.
1. 6. 3 土壤中可培养微生物数量测定 土壤中可培养微生物( 细菌、真菌、放线菌) 数量测定均采用平板菌落计数法[18]测定，并在测定前计算土壤水分系数.其中细菌数量采用 LB 培养基涂布测定; 放线菌数量采用高氏一号培养基涂布测定; 真菌数量采用 PDA 培养基涂布测定.
1. 6. 4 土壤酶活性测定 参照关松荫[19]的方法.土壤蔗糖酶活性测定采用比色法，以 1 d 后 1 g 土壤中所生成葡萄糖的质量 ( mg) 表 示 蔗 糖 酶 活 性，用 mg·g-1 ·d-1 表示.土壤磷酸酶活性测定采用磷酸苯二钠比色法，以 1 d 后 1 g 土壤中的 P2O5毫克数表示磷酸酶活性，用mg·g-1 ·d-1 表示.土壤过氧化氢酶活性测定采用高锰酸钾滴定法，以 1 g 土壤每分钟消耗 的 H2 O2 毫克数表示过氧化氢酶活性，用 mg·g-1 ·min-1 表示.土壤脲酶活性测定采用比色法，以 1 d 后 1 g 土壤所生成 NH3-N 的质量( mg) 表示脲酶活性，用 NH3-N mg·g-1 ·d-1 表示.
1. 7 数据处理
采用 Excel 2010 和 SPSS 22.0 软件对试验数据进行统计分析.采用单因素( one-way ANOVA) 法进行方差齐性检验，其中方差齐性的数据采用 Duncan 法进行差异显著性检验( α= 0.05) ，方差不齐的则采用非 参 数 Kruskal-Wallis 法进行差异显著性检验 ( α= 0.05) .表中数据为平均值±标准差.
2 结果与分析
2. 1 菌种的分离与筛选
从苹果根际土壤中共分离出 142 株细菌，通过平板对峙法对 142 株细菌进行目的菌株的筛选.经过反复筛选，其中有 7 株对苹果连作障碍主要致病原真菌( 层出镰刀菌、串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌) 具有较强拮抗效果，而菌株 B6 的拮抗效果最为明显，对层出镰刀菌、串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌和腐皮镰孢菌的抑菌率分别达到( 71.8±1.4) %、( 70.1±1.9) %、( 72.6±4.8) %、( 91.5±0.7) %( 图 1) .
2. 2 目的菌株的鉴定
2. 2. 1 形态特征 形态学鉴定显示，菌株 B6 在 LB 培养基上 37 ℃ 培养 24 h 后，其单菌落较大、乳白色、不透明、不规则、隆起、边缘波状、表面褶皱湿润.显微观察发现，该菌革兰氏染色阳性、菌体为棒状、有芽孢、大部分两节连在一起，长约 2 μm、宽约 1 μm( 图 2) .
2. 2. 2 生理生化特征 将菌株 B6 的生理生化测定结果( 表 1) 与《常见细菌系统鉴定手册》[18]中收录的属、种进行比较，发现其与芽孢杆菌属的典型特征基本 一 致，初 步 认 为 菌 株 B6 属 于 芽 孢 杆 菌 属 ( Bacillus) .
2. 2. 3 菌株的分子生物学鉴定 以菌株 B6 的总基因组 DNA 为模板，利用 16S rDNA 细菌通用引物进行PCR扩增，扩增片段测序后大小为1407 bp.然后将 B6 的 16S rDNA 序列与在 Gen Bank 中已注册的序列进行 Blast 序列比对，并利用软件 MEGA7.0 构建系统发育树.结果显示，B6 与甲基营养型芽孢杆菌( Bacillus methylotrophicus) 同源关系最近，序列相似性达到 97%( 图 3) ，结合形态观察和生理生化试验结果，鉴定菌株 B6 为甲基营养型芽孢杆菌.
2. 3 B6 菌肥处理对平邑甜茶幼苗生物量的影响
由表 2 可以看出，与对照组( CK1 ) 相比，B6 菌肥处理( T) 可以不同程度地促进平邑甜茶幼苗生物量的增加.其中地径、鲜质量、干质量增加幅度都达到显 著 性 水 平，增 加 量 分 别 为 18. 3%、49. 6%、 51.2%; 而菌肥载体处理( CK3 ) 与对照组相比，两者之间的平邑甜茶生物量无明显差异; B6 菌肥处理的平邑甜茶幼苗的长势也未能超过溴甲烷熏蒸处理 ( CK2 ) .
2. 4 B6 菌肥处理对土壤中可培养微生物的影响
由表 3 可以看出，与对照组相比，添加菌肥 B6 和菌肥载体都可以增加连作土壤中细菌和放线菌的数量，但是添加菌肥 B6 可以显著降低连作土壤中真菌数量，使真菌数量下降为连作土壤中的 37.7%，而添加菌肥载体不仅没有减少连作土壤中真菌的数量，反而增加了 6.7%，而溴甲烷熏蒸处理可以降低连作土壤中真菌的数量，但也不同程度地降低了连作土壤中细菌和放线菌的数量.
2. 5 B6 菌肥处理对连作土壤酶活性的影响
由表 4 可以看出，与对照组相比，B6 菌肥 处理可以显著提高连作土壤中的蔗糖酶、磷酸酶、脲酶以及过氧化氢酶的活性，其相对增长率分别为 37.3%、24.0%、42.9%、49.4%; 菌肥载体处理对连作土壤中蔗糖酶、磷酸酶、脲酶以及过氧化氢酶的活性也有不同程度的提高，但是其相对增加量远不如 B6 菌肥处理; 而溴甲烷熏蒸处理却不同程度地降低了这 4 种土壤酶的活性，其中蔗糖酶和脲酶活性降程幅达到显著水平.
3 讨 论
土壤微生物作为土壤中最活跃的肥力因子之一[20]，其种群组成和多样性在很大程度上决定着土壤中营养物质的代谢和能量流动，并影响着土壤生态系统的功能[21].研究表明，连作的发生与土壤微生物生态系统的失衡密切相关.因为长期连作使得土壤中有益微生物大量减少，病原微生物大量增加，土壤类型向着真菌主导型转化，使病原菌更易侵染植株而引起各种病虫害[22].通过调节土壤环境( 例如施加生防菌菌肥) 可以改变土壤微生物的种群组成和多样性，影响土壤生态系统功能[21]，从而达到防控连作障碍的目的.在本试验中，对连作条件下的盆栽平邑甜茶幼苗进行 B6 菌肥处理后发现，连作土壤中真菌数量显著降低，细菌和放线菌数量显著增多，平邑甜茶幼苗生物量有不同程度的增加.可见该菌肥处理可以促使苹果连作土壤由真菌主导型向细菌主导型转化，从而优化连作土壤中的可培养微生物群落结构，改善土壤生态系统，使得土壤中的营养物质转化与分解速率加快，继而增加土壤肥力，缓解苹果连作障碍.这与前人施用微生物菌肥增加根际土壤微生物种群丰富度和多样性指数，从而缓解土壤连作障碍的研究结果较为一致[23-24].
土壤酶主要来源于土壤中动植物残体分解、植物根系分泌和土壤微生物的活动[19]，是一类具有生物化学催化活性的特殊物质，积极参与着土壤生态系统中的物质循环与能量转化[25]，较高的酶活性水平可在一定程度上保证作物在土壤肥力贫瘠的土地上生长良好[26].研究表明，连作会使土壤磷酸酶、脲酶、蔗糖酶和过氧化氢酶的活性降低[27].这可能是连作导致土壤理化性质恶化的表现之一[28].在本研究中，B6 菌肥处理可以显著地提高连作土壤中的蔗糖酶、磷酸酶、脲酶以及过氧化氢酶的活性，其相对增长率分别达到 37.3%、24.0%、42.9%、49.4%; 而溴甲烷熏蒸处理却不同程度地降低了这 4 种土壤酶的活性，其中蔗糖酶以及脲酶降低程度达到显著水平.此结果与前人的研究基本一致[9，29].菌肥载体处理也相对增加了这 4 种土壤酶的活性，但是其相对增加量远不如 B6 菌肥.可见，B6 菌可以提高土壤酶活性，从而更有利于植株对营养成分的吸收，最终促进植株生长.
本试验利用平板对峙法从老苹果树根际土壤筛选出甲基营养型芽孢杆菌 B6.在室内试验条件下，其对中国环渤海地区苹果连作障碍主要致病真菌层出镰刀菌、串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌和腐皮镰孢菌具有较强的拮抗作用，抑菌率分别达到( 71.8±1.4) %、 ( 70.1±1.9) %、( 72.6±4.8) %、( 91.5±0.7) %.在盆栽条件下，B6 菌肥可以不同程度地促进平邑甜茶幼苗生物量的增加，显著提高连作土壤中蔗糖酶、脲酶、过氧化氢酶和磷酸酶的活性，显著地降低连作土壤中可培养真菌的数量，增加细菌、放线菌的数量，使得土壤向细菌型土壤转化，说明该菌制成的菌肥可以优化苹果连作土壤中的可培养微生物群落结构，改善土壤生态系统，增加土壤酶活性.其中前两者加快了土壤中营养物质的转化与分解速率，从而增加了土壤肥力; 而土壤酶活性的提高则促进了植株对营养成分的吸收，最终促进平邑甜茶幼苗的生长，在一定程度上减轻了苹果连作障碍.综上，该菌的抑菌、促生效果明显且针对性强; 该菌可产生芽孢，对外界有害因子抵抗力强，与过去筛选的苹果连作障碍生防菌株相比，具有更大的开发潜力.但是该菌在田间条件下是否也可以产生相似的效果以及其抑真菌机制则有待于进一步探究.
苹果连作生防细菌B6对平邑甜茶幼苗生物量及连作土壤环境的影响相关期刊推荐：《应用生态学报》(月刊)是中国科学院主管、中国生态学学会和中国科学院沈阳应用生态研究所联合主办的综合性学术期刊，创刊于1990年，由科学出版社出版。本刊主要报道应用生态学领域的创新性科研成果与科研进展，反映我国应用生态学的学术水平和发展方向，跟踪学科发展前沿，注重理论与应用结合，促进国内外学术交流合作与人才培养。
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