摘要：为探索抗氧化剂对寒富苹果酒发酵过程的影响，以寒富苹果为原料，对其发酵过程中的营养成分、色泽以及多酚的抗氧化能力变化规律进行研究，为生产优质寒富苹果酒提供理论依据。结果表明：在寒富苹果酒发酵过程中，0.1%氯化钠(NaCl)、200mg·L-1赖氨酸(Lys)、200mg·L-1维生素C(Vc)、0.1%柠檬酸(CA)、200mg·L-1葡萄糖氧化酶(GOD)5种抗氧化剂的添加对寒富苹果酒的可溶性固形物、酒精度变化影响较小;可溶性固形物在发酵过程中整体呈下降趋势，由初始的22%降至15d的2.2%，20d降到2%;酒精度在发酵期内呈快速上升趋势，发酵15d上升至8.0%vol以上，发酵20d时的酒精度达到8.5%vol(CK、NaCl、Lys处理)，而经过CA和GOD处理后，酒精度于发酵结束时达到最低值8.0%vol。色泽方面，Vc处理护色效果最佳，投入初始就可保证发酵液呈黄色，而其他处理组发酵液此时呈深褐色，发酵过程中颜色逐渐变浅，发酵后期CA处理组也有较好护色效果。总酚含量在发酵的过程中呈现先升高后下降的趋势，5d达到最大值;含量由最初的297.54mg·L-1增加到最大值为707.94mg·L-1(Vc处理)，发酵结束时最低为119.63mg·L-1(Lys处理);Vc在5种抗氧化剂中保护酚类能力最为突出。抗氧化剂处理后发酵液的清除DPPH自由基的能力整体呈下降趋势，由最初95%降至82%。T-AOC总抗氧化活性与总酚含量变化波形具有一致性，Vc处理能明显增强发酵液还原Fe3+的能力。清除ABTS+·的能力在发酵过程中出现一定的波动，总体呈现下降趋势，Vc处理能增强发酵液清除ABTS+·的能力。综上所述，抗氧化剂对寒富苹果酒的发酵进程无明显控制作用，能够保证发酵正常进行，Vc在寒富苹果酒护色方面，提高寒富苹果酒营养及功能方面，表现突出，可应用于寒富苹果酒生产制造中。
关键词：寒富苹果;抗氧化剂;总酚;发酵;抗氧化能力
寒富苹果是由沈阳农业大学选择培育出的抗寒性极强的优质苹果品种[1]，其果实具有个大整齐、酥脆多汁的特点，同时相较于富士等品种，表现出了极好的耐贮藏性[2-4]。近年来，寒富苹果在全国各地得到了广泛的种植，寒富苹果的种植面积不断扩大、产量不断增加，价格却一路走低。为解决这一生产矛盾，保护广大农户的利益，开展寒富苹果深加工研究十分必要[5]。苹果酒是苹果原汁经过发酵得到的一种低酒精度的果酒[6]，苹果酒保留了苹果原有的糖类、氨基酸、矿物质以及苹果特有的有机酸等物质，同时富含具有抗氧化活性的酚类物质，营养丰富，具有保健功效[7-9]。目前，国内外的消费者越来越青睐于苹果酒等低酒精度果酒[10]，这就使生产寒富苹果酒成为寒富苹果加工利用的新方向。
苹果酒生产中的氧化褐变问题是影响其品质的重要因素，在果酒生产中常通过添加抗氧化剂的方法阻止酒体的劣变[11]。目前，国内外常用的抗氧化剂有很多，本试验选用的5种抗氧化剂在果蔬保鲜加工领域应用广泛。维生素C，又称抗坏血酸，作为一种多糖化合物，它本身就具有很强的抗氧化能力，还作为鲜水果品质的重要衡量指标，同时在鲜切水果保鲜[12-13]、果酒防褐变方面[14-15]均有突出贡献;赖氨酸可有效延长鲜切果蔬货架期，有效控制鲜切菠菜细菌含量，有很好的护色抗氧化作用[16-17]，其参与美拉德反应后的产物有很大抗氧化活性[18];葡萄糖氧化酶具有酶的专一性，同时有天然无污染的特点，被广泛应用于果汁[19]、果酒[20]酿造中，起到防止褐变，延长保质期的作用;而氯化钠和柠檬酸也在保鲜和果酒抗氧化方面有很多应用，苹果酒中加柠檬酸可有效控制美拉德反应，防止褐变发生[21-22];氯化盐有较好的果蔬护色效果，其能力堪比稍贵的抗坏血酸盐，可成为其低价替代品[23]，但根据学者们的相关研究总结，1%~1.5%(w/v)才能起到很好的抗氧化及护色作用。本试验将寒富苹果作为原材料，通过研究不同抗氧化剂对苹果果酒酿造过程中营养成分及酚类物质与其抗氧化活性的影响，选择合适的抗氧化剂用于寒富苹果酒的生产，进而达到推动寒富苹果酒发酵向有利方向发展的目的，为市场提供营养丰富的苹果酒新品;同时，可解决寒富苹果的产量过剩的问题，提高寒富苹果种植经济效益，促进寒富苹果产业健康发展。
1材料与方法
1.1材料、试剂及仪器
原料：寒富苹果，2016年10月9日购于沈阳市东陵区深井子金德胜果园，表面全部转红，完全成熟，大小不分级，运回实验室5℃冷库中存贮。
主要试剂：白砂糖(广州福正东海食品有限公司);活性干酵母(安琪酵母股份有限公司);福林酚试剂、一水合没食子酸[鼎瑞化工(上海)有限公司];无水乙醇、焦亚硫酸钠、赖氨酸、维生素C、柠檬酸、氯化钠、葡糖氧化酶、碳酸钠(沈阳沈一精细化学品有限公司);总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒、二苯基三硝基苯肼(DPPH)、总抗氧化能力检测试剂盒(ABTS法)(上海鼎国生物技术有限公司)。
主要仪器：MJBL25B26榨汁机(广州美的集团股份有限公司);AE523电子天平(上海恒平科学仪器有限公司);pH7110/7310实验室台式pH/mV测试仪(上海邦沃仪器设备有限公司);JC510-AY32手持式糖度折光仪(北京百万电子科技有限公司);Q-250ES超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);UV1902PC紫外可见分光光度计(上海奥析科学仪器有限公司);KXW-80A旋涡混合器(上海琪特分析仪器有限公司);全波长酶标仪[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]。
1.2方法
1.2.1寒富苹果酒试验处理将寒富苹果从冷库中取出后置于22℃室温，清洗后，通心去核，切分后榨汁处理。为使榨出苹果汁初始成分相同，对苹果汁进行成分调整。试验中寒富苹果榨汁后的糖度为140g·L-1，通过添加白砂糖的方式调整苹果汁糖度至220g·L-1。混匀后，分装于发酵瓶中，每瓶2L。5瓶分别添加1g·L-1NaCl、1g·L-1柠檬酸(citricacid，CA)、200mg·L-1Vc、200mg·L-1Lys、200mg·L-1葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase，GOD)作为5个处理组，原汁发酵作为对照组，再分别添加200mg·L-1安琪活性干酵母(需要提前0.5h用10倍温水活化，添加10%蔗糖，让酵母充分生长，有酸味与气泡产生)，混匀后置于室温(22℃)、避光条件下进行静置发酵。每天观察发酵情况，每天至少摇晃2~3次，每5d测定1次指标，20d后过滤，倒罐进行后发酵。
各抗氧化剂使用量是通过大量文献阅读参考后确定的，其中氯化钠和柠檬酸使用量稍多，是由于氯化钠和柠檬酸使用量需达到1%~2%(w/v)才能起到较好的护色抗氧化作用，而考虑到氯化钠和柠檬酸自身味感对酒体口感的影响，选择添加浓度为1g·L-1，这样既能保证抗氧化效果同时又不影响苹果酒口感。
1.2.2酒精计法测定酒精度参照GB/T15038-2006中果酒酒精度的测定方法[24]。
1.2.3手持式糖度折光仪测定可溶性固形物的测定取待测发酵液数滴，置于手持式糖度折光仪的检测棱镜上，将仪器进光板对准光源进行读数测定。测定时应注意用蒸馏水进行调零后再测量，测定过程中注意避免气泡的产生，同时注意测定时的温度校正。
1.2.4福林酚法测定总酚含量没食子酸标准曲线的绘制：首先配制1000mg·L-1没食子酸标准溶液，再用蒸馏水稀释配备质量浓度为0，10，20，30，40，50mg·L-1的没食子酸标准溶液。避光条件下用移液枪分别移取6种质量浓度不同的1mL没食子酸标准溶液于6个试管中，分别依次加入蒸馏水5mL、等体积稀释后的FC试剂1mL、7.5%的Na2CO33mL，用涡旋混合器进行均质。显色90min后，用紫外分光光度计于765nm波长下测定吸光值，重复3次。以吸光度值为纵坐标，一水合没食子酸含量为横坐标进行线性回归，绘制标准曲线。
寒富苹果酒中总酚含量的测定：取寒富苹果酒发酵液50mL于烧杯中，加入150mL的无水乙醇，使用超声波进行辅助提取10min，之后静置30min，将所得溶液抽滤后在45℃下旋蒸至干燥后，乙醇溶解定容至50mL后抽滤，制成各处理多酚提取液。取寒富苹果多酚提取液1mL，按照没食子酸标准曲线的测定方法测得各寒富苹果酒发酵液样品的吸光值，代入回归方程后可计算出总酚的含量，每组样品重复3次。
1.2.5DPPH法测定清除自由基能力参考吕春茂等[25]的方法并略加修改。
寒富苹果酒发酵液作为待测样本，按照表1依次向A0，Ai，Aj试管中加入相应试剂再进行测定。其中DPPH溶液的制备，需要准确称取0.1984gDPPH，用无水乙醇溶解定容至250mL，再取10mL定容后的液体，用无水乙醇稀释至100mL作为DPPH待用液。充分混匀后室温静置30min，用紫外分光光度计于734nm波长下测量试管A0、Ai、Aj对应吸光度(OD)值D0、Di、Dj，注意测定前用蒸馏水调零，平行测定3次。
1.2.6T-AOC法测定总抗氧化能力取寒富苹果发酵液作为待测样本，对照管添加样本为蒸馏水。根据试剂盒测定方法按照表2加入相应溶剂，配制成应用液。混合试剂是由试剂一、试剂二、试剂三按照1∶2∶0.5的比例配制而成，其中试剂二为白色晶体，使用前需用120mL双蒸水溶解，混合试剂需要现用现配，注意添加完混合试剂后要用涡旋混合器充分混匀，并于37℃水浴30min。所有溶剂添加完后室温反应10min，用紫外分光光度计于520nm波长处分别测出对照管和测定管对应的吸光度(OD)值，注意测定前用双蒸水进行调零，平行测定3次。37℃条件，每分钟反应体系由于每毫升的样品加入，吸光度值增加0.01时，可作为一个总抗氧化能力的单位。
1.2.7ABTS法测定总抗氧化能力取寒富苹果发酵液作为待测样本，根据试剂盒方法按照表3依次向对应孔位加入试剂，进行测定。ABTS工作液是由ABTS工作母液(ABTS溶液∶氧化剂溶液=1∶1混合均匀后室温下避光放置14h)用80%乙醇稀释45倍得到的，注意现用现配。所有试剂添加完成后于室温条件下孵育3min，用酶标仪于734nm处测定各孔对应吸光度(OD)值，平行测定3次。以总抗氧化能力(不同Trolox标准品浓度)为横坐标，标准孔对应OD值为纵坐标进行线性回归，绘制标准曲线。将待测样本对应测定孔OD值代入方程，得到寒富苹果发酵液的总抗氧化能力。
2结果与分析
2.1抗氧化剂对寒富苹果酒发酵过程可溶性固形物变化的影响
由图1可知，添加NaCl、Lys、Vc、CA、GOD这5种抗氧化剂处理与不添加任何抗氧化剂的原汁发酵CK组相比，可溶性固形物变化规律基本相似。可溶性固形物含量总体呈下降趋势，从初始的22%，发酵15d内快速降至2.2%，之后变化缓慢，发酵20d基本在2.0%。这是因为苹果酒的发酵过程中对糖类物质的消耗主要是微生物促使葡萄糖等有机物向酒精转变，与此同时，氨基酸和蛋白质等含氨基的物质也会与糖类物质反应，使可溶性固形物减少。由图1还可知，加入抗氧化剂发酵的前5d，添加Vc与Lys两组的可溶性固形物含量下降缓慢，添加Vc后的5d，可溶性固形物含量只减少3.8%，添加Lys后可溶性固形物含量降低5.4%，而其他组与对照组无明显差异，可溶性固形物含量降低7%。可见，这5种抗氧化剂除Vc前期可明显减缓可溶性固形物消耗速度外，其他处理对可溶性固形物的发酵影响不大。
2.2抗氧化剂对寒富苹果酒发酵过程酒精度变化的影响
酒精是果酒的主要成分，也是果酒区别于果汁的重要成分之一，同时酒精的生成速度是检验果酒发酵过程是否顺利的重要指标。由图2可知，添加5种抗氧化剂处理组与对照组相比，酒精生成规律基本相似，同时生成趋势也与可溶性固形物的消耗趋势表现出了契合性，酒精度在前10d快速升高至7.0%vol，10~15d生成速度减缓，15d达到8.0%vol以后酒精度基本不再变化，标志着发酵过程的基本结束。相比之下，发现发酵的前5d，Vc、CA及GOD处理组与CK相比，酒精浓度升高缓慢，Vc处理组在发酵的前5d酒精生成量只有2.3%vol，CA、GOD组酒精生成量在2.5%vol，而对照组自然发酵条件下酒精生成量在4.2%vol。经过20d的发酵，NaCl、Lys处理组合CK组的酒精度达到8.5%vol，而经过CA和GOD处理后，酒精度只有8.0%vol，但可以发现发酵结束时，添加抗氧化剂组与对照组最后的酒精度均稳定在8.3%vol，可见，添加Vc、Lys及GOD这3种抗氧化剂可以在发酵前期减缓酒精生成速度，但并不影响寒富苹果酒正常的发酵进程。
2.3抗氧化剂对苹果酒发酵过程中色泽的影响
由图3可知，寒富苹果酒发酵过程中其颜色逐渐变浅，发酵液逐渐变得清澈透明。添加抗氧化剂当天，Vc组的护色效果明显优于其他处理组和对照组，苹果汁呈现黄色，其他抗氧化剂处理组都呈现黄褐到褐色。在发酵的0~5d，发酵液开始有气泡产生，同时酒体中存在大量絮状物。到了发酵的5~10d，苹果汁颜色逐渐变浅，絮状物逐渐减少，但由于酒体的浑浊，各个抗氧化剂处理之间颜色差异不明显。发酵15d后，发酵过程变得非常缓慢，气泡明显减少，果渣基本沉淀到底部，颜色明显变浅。发酵20d后，发酵基本停止，离心过滤处理后酒体澄清，颜色以浅黄到浅黄褐色。此时各处理组与对照组颜色差异不明显，可以看到CA处理组护色效果稍好一点，同时发现在发酵初期表现出良好护色效果的Vc处理组，在后续发酵过程中护色效果逐渐减弱。
2.4抗氧化剂对寒富苹果酒发酵过程中总酚含量的影响
由图4可知，曲线的回归方程为y=0.005x+0.0814，R2=0.9997，说明在总酚含量在0~35mg·L-1之间，吸光度值与浓度呈现良好的线性关系。根据没食子酸标准曲线，可计算出样品中总酚的含量。由图5可知，寒富苹果酒发酵过程中Vc、Lys及GOD处理组和对照组总酚含量变化规律一致，呈现出先升高后下降的趋势。Vc处理组总酚含量明显高于其他组，在发酵初期达到560mg·L-1，总酚含量比CK组高263mg·L-1，发酵5d后上升到707mg·L-1，发酵20d后含量降低到231mg·L-1，但总酚含量仍比其他处理组高112~55mg·L-1;Lys与CA处理组在发酵初期总酚初始含量是320mg·L-1，与其他几组表现不同的是，在后续发酵过程中总酚含量持续下降，未出现升高的现象，到20d后总酚含量降低到120mg·L-1;所有组在寒富苹果酒发酵的5~20d总酚含量的持续下降，同时在发酵的5~10d之间下降速度较快。总体看来，Vc处理组总酚含量远高于其他处理组，Vc是5种抗氧化剂中对总酚保护作用表现最突出的。
2.5抗氧化剂对寒富苹果发酵液清除DPPH自由基能力的影响
寒富苹果酒发酵过程中，发酵液的DPPH自由基清除能力总体呈现下降趋势，不同处理组的清除DPPH自由基能力变化规律不明显，清除率在94.62%到80.42%之间波动，其效果如图6。由图6可知，NaCl与CA抗氧化剂处理能够提高初始的DPPH自由基清除能力，清除率初始值最高的是CA处理，为94.62%;其次是NaCl的92.08%，其他处理与对照接近89%。发酵10d时，NaCl处理与CA处理清除率急剧下降;NaCl处理清除率降低到最小值80.42%，CA处理清除率降低到最低值83.52%，之后这两个处理的DPPH自由基清除能力又有所升高;其他处理清除率一般90%，保持平稳下降趋势。Vc处理组在整个过程中都表现出极好的清除能力，且发酵20d时，Vc处理清除率最高，为88.07%，清除率最低的是Lys处理，为82.07%。发酵结束后，只有Vc处理清除率基本不变，其他处理都有所降低。同时值得注意的是，虽然NaCl处理组清除DPPH自由基的能力波动性很大，但在20d发酵结束时，清除效果仅次于Vc。寒富苹果酒发酵液的DPPH自由基清除能力结果与总酚含量总体变化上具有一致性，但是没出现第5d时，清除率随含量急剧升高的现象，这个过程的具体原因还需要进一步探索。
抗氧化剂对寒富苹果酒发酵过程成分及抗氧化性的影响相关期刊推荐：《沈阳农业大学学报》是沈阳农业大学主办的综合性农业学术期刊，主要刊登农业工程、作物学、园艺学、农业资源利用、植物保护、动物科学、生物学、林学、食品科学等方面的专论、研究报告、研究简报、实验技术等。曾用刊名：沈阳农学院学报
转载请注明来自：http://www.lunwencheng.com/lunwen/nye/16584.html
