摘要：为解决益生菌不耐低pH值、不耐氧的缺点，采用微胶囊包埋技术，以海藻酸钠为壁材用乳化法制备长双歧杆菌藻酸盐微胶囊。将基础藻酸盐微胶囊外包壳寡糖(chitosanoligosaccharides，COS)或在藻酸盐壁材中添加藻酸盐寡糖(alginateoligosaccharides，AOS)分别制备两种海洋寡糖微胶囊：COS-微胶囊和AOS-COS-微胶囊。体外实验表明：两种海洋寡糖微胶囊均可以显著提高长双歧杆菌在模拟消化液处理后或在4℃贮藏期内的存活率。AOS-COS-微胶囊在模拟胃液处理后仍能保持106CFU/g以上的活菌数。在连续的模拟消化液处理后，AOS-COS-微胶囊中的活菌量达到基础微胶囊中的约1000倍。两种海洋寡糖微胶囊在4℃贮藏28d后仍均能保持108CFU/g以上的活菌数。体内实验表明：相比较未包埋的长双歧杆菌或基础微胶囊，海洋寡糖微胶囊可以显著提高动物肠道菌群中益生菌的含量，同时降低条件致病菌的含量，具有最佳的调节肠道菌群效果。因此，海洋寡糖益生菌微胶囊产品将是一种有巨大应用前景的新型功能性益生菌食品。
关键词：益生菌;微胶囊;海洋寡糖;肠道菌群;高通量测序
作为一种功能性食品，益生菌产品具有调节肠道菌群的作用。根据联合国粮农组织和世界卫生组织(FAO/WHO)的定义，益生菌是活的微生物，当摄取足量时可对宿主的健康带来益处[1-2]。双歧杆菌是一种严格厌氧的革兰氏阳性菌，其菌体数量会在生产加工处理和通过胃肠道的过程中大量减少，瑞士和国际乳联标准化委员会规定益生菌产品中双歧杆菌的活菌数需大于106CFU/g或106CFU/mL[3]，因此为双歧杆菌提供保护以抵御不利环境十分必要。微囊化技术可以通过一定的理化手段将益生菌包裹在微小且封闭的胶囊中，不仅能在加工或贮藏过程中提高益生菌的有效活菌数，还能在通过胃肠道期间对益生菌进行保护，使其以较少的活性损失到达肠道靶位点[4]。由于Ca2+-藻酸盐凝胶的安全和无毒性质，它是最常用的微囊化壁材[5]。
Ca2+-藻酸盐微胶囊的多孔性会导致消化液或氧渗入微胶囊内部，从而造成益生菌的活性损失。壳聚糖作为一种无毒无害的阳离子材料通常用于涂覆藻酸盐微胶囊，为益生菌提供更好的保护[6]。然而壳聚糖(平均分子质量高于10000Da)完全溶解所需要的低pH值环境[7]可能会降低益生菌的活性[6]。与长链的壳聚糖相比，带正电的短链壳寡糖(chitosan-oligosaccharides，COS)在中性环境中具有更好的水溶性。此外，COS可以作为益生元促进双歧杆菌和乳酸菌的生长，并具有调节肠道菌群和减轻结肠炎的作用[8-9]。因此认为具有COS涂层的益生菌微胶囊具有两种性质：作为包衣材料，增强微胶囊对益生菌的保护作用;作为益生元，当益生菌在肠中释放时促进益生菌的生长。虽然有报道显示具有COS涂层的藻酸盐微胶囊具有良好的生物相容性、良好的机械稳定性、无毒性和生物可降解性[10]，但目前这种微胶囊很少用于益生菌的包埋。
除用阳离子材料涂覆于微胶囊表面，将益生元添加于微胶囊的藻酸盐壁材中也被认为是改善产品中益生菌细胞活力的有效方法：在体外模拟胃肠液处理或在一定条件下贮藏一段时间后，与益生元共同包封可以使益生菌具有更高的活性[11-12]。目前，通常用于这种共包封微胶囊的益生元包括果寡糖、菊粉、低聚半乳糖等。藻酸盐寡糖(alginate-oligosaccharides，AOS)是通过酶水解藻酸盐获得的海洋寡糖，对动物消化道酶具有高度抗性，可作为益生元促进双歧杆菌和乳酸杆菌的生长。对于包括长双歧杆菌在内的部分益生菌，AOS的益生元作用甚至优于常用的益生元果寡糖[13]。因此，AOS被认为是一种可用作益生菌和益生元共包封微胶囊的优质益生元。
为探究海洋寡糖微胶囊对益生菌的保护作用，以及在实际应用中的价值，制备包埋长双歧杆菌CICC6259的基础微胶囊。将基础微胶囊外包COS，或添加AOS且外包COS分别制备两种海洋寡糖长双歧杆菌微胶囊：COS-微胶囊和AOS-COS-微胶囊。通过体外和体内实验研究这些海洋寡糖益生菌微胶囊对长双歧杆菌的保护作用，并通过体内实验研究其对小鼠肠道菌群的调节作用，以期为新型益生菌微胶囊的研发和体内体外评估提供参考与指导。
1材料与方法
1.1材料与试剂
长双歧杆菌CICC6259购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，分离自乐赛牌益生菌胶囊;MRS培养基青岛海博生物技术有限公司;海藻酸钠(黏度500mPa·s，食品级)青岛明月海藻集团有限公司;胃蛋白酶、胰蛋白酶美国Sigma公司;胆盐天津市博迪化工有限公司;壳寡糖(脱乙酰度90%，分子质量<1500Da，纯度>90%)青岛博智汇力生物科技有限公司;饲料南通特洛菲饲料科技有限公司;AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒美国AXYGEN公司;TaqDNA聚合酶、DL2000DNAMarker、热启动SYBRGreen实时定量聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)预混液、StoolDNAKit粪便基因组DNA提取试剂盒、BacterialDNA96Kit细菌基因组DNA提取试剂盒、GelExtractionKit切胶回收试剂盒美国OmegaBioTek公司;藻酸盐寡糖(以三糖和四糖为主)由本实验室自制;其他试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。
1.2仪器与设备
SK-1型快速混匀仪常州精宏实验设备有限公司;YQX-II型厌氧培养箱上海新苗医疗器械制造有限公司;LDZX-75KBS立式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂;SW-CJ-1D超净工作台苏州博莱尔净化设备有限公司;ST16R高速冷冻大容量离心机、MultiskanSky全波长酶标仪、UVP凝胶成像系统赛默飞世尔科技(中国)有限公司;ME203E/02型电子天平梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;BX51光学显微镜奥林巴斯(中国)有限公司;7900HT荧光定量PCR仪美国AppliedBiosystems公司;PowerPacBasic电泳仪美国Bio-Rad公司;P330微量蛋白核酸分析仪德国Implen公司。
1.3方法
1.3.1主要溶液的配制
解囊液：将NaHCO3溶于0.1mol/LpH7.0磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersolution，PBS)中(NaHCO3的终浓度为0.2mol/L)，过滤除菌。
模拟胃液[6]：用浓盐酸将2mg/mLNaCl溶液的pH值调至2.0，再加入胃蛋白酶并使最终质量浓度达到0.3g/L，过滤除菌。
食管到胃连续过程的模拟液[14]：将5mg/mL的胃蛋白酶溶于MRS肉汤中，分别将pH值调节至5.5、4.6、3.8、2.8、2.3、2.0，过滤除菌。
十二指肠模拟液[14]：将10mg/mL的胰蛋白酶和3mg/mL的胆盐分别溶于MRS肉汤中，将pH值调节至5.0，过滤除菌。
小肠模拟液[14]：用0.1mol/L的NaHCO3溶液将上述十二指肠模拟液的pH值调节至6.5，过滤除菌。
1.3.2菌体的活化与培养
将长双歧杆菌CICC6259按1∶10(V/V)的接种量接种于无菌MRS肉汤中，于37℃恒温厌氧培养24h。活化3次后，按1∶10(V/V)的接种量接种于无菌MRS肉汤中，于37℃恒温厌氧培养24h。4000r/min离心5min收集菌体，用无菌生理盐水(0.85%NaCl)洗涤2次并重悬后，将浓缩菌液的浓度调节至1010CFU/mL。
1.3.3基础微胶囊的制备
采用外源乳化法[15]制备基础微胶囊。将浓缩菌液、无菌海藻酸钠溶液(30mg/mL)和含有(2μL/mL)吐温80的无菌玉米胚芽油以2∶3∶25(V/V)的比例混合。200r/min磁力搅拌5min将混合物(总体积50mL)乳化。向乳化液中迅速加入100mL无菌CaCl2溶液(20mg/mL)，继续搅拌30min。2000r/min离心5min收集微胶囊，在4℃用体积分数0.1%无菌蛋白胨溶液洗涤2次以除去过量的钙离子和未被包裹的益生菌，然后用无菌生理盐水洗涤。
1.3.4具有COS包衣的微胶囊(COS-微胶囊)的制备
基于ZouQiang等[6]的壳聚糖包衣方法，采用两步法制备COS包衣的微胶囊。将0.5gCOS溶解于90mL蒸馏水中，用0.1mol/L的NaOH溶液将pH值调节至7.0，再用蒸馏水将溶液的总体积调节至100mL，得到5mg/mL的COS溶液。将10g基础微胶囊浸入100mL过滤除菌的5mg/mLCOS溶液中，用磁力搅拌器100r/min搅拌20min进行涂覆。过滤收集微胶囊。
1.3.5添加AOS且具有COS包衣的微胶囊(AOS-COS-微胶囊)的制备
在Krasaekoopt等[16]方法基础上，稍作修改。将灭菌的AOS溶解于1.3.2节的浓缩菌液中，使AOS在菌液中的质量浓度达到12.5mg/mL，微胶囊的制备方法与1.3.3节相同。最终微胶囊中AOS的质量浓度为5mg/mL。COS包衣的方法与1.3.4节相同。过滤收集微胶囊。
1.3.6微胶囊包埋的活菌数及包埋率的测定
准确称取3种湿微胶囊样品各1g，加入9mL解囊液中，振摇10min至完全解囊。将混合液梯度稀释后涂布于MRS琼脂上，37℃厌氧培养72h并计数。
1.3.7长双歧杆菌的体外耐胃酸实验
分别取3种微胶囊各1g，或菌液1mL，置于在37℃预热的9mL模拟胃液中，于37℃、100r/min的摇床中温育2h。在5、30、60、120min时，取微胶囊或菌液与模拟胃液的均匀混合物各1mL，加入9mL解囊液中，振摇10min至完全解囊。将混合液梯度稀释后涂布于MRS琼脂上，37℃厌氧培养72h并计数。
1.3.8长双歧杆菌在模拟消化道体系中的存活实验及微胶囊的崩解实验
参照李军等[14]的模拟消化道体系。分别取3种微胶囊各1g或菌液1mL，置于在37℃预热的9mL模拟消化液中，于37℃、100r/min的摇床中温育。每次更换模拟消化液前，以8000r/min离心1min沉淀菌体和微胶囊，再用移液器将上清液小心地吸出。每次更换模拟消化液后，涡旋30s以充分混合。处理步骤如表1所示。
分别在食管到胃的模拟液、十二指肠模拟液和小肠模拟液处理后，取微胶囊或菌液与模拟消化液的均匀混合物各1mL，加入9mL解囊液中，振摇10min至完全解囊。将混合液梯度稀释后涂布于MRS琼脂上，37℃厌氧培养72h并计数。
微胶囊在模拟消化道体系中的崩解实验参照Annan等[17]方法：每隔5min取微胶囊与模拟消化液的均匀混合物，于光学显微镜下观察，记录微胶囊的崩解时间。
1.3.9长双歧杆菌CICC6259在4℃贮藏稳定性实验
在ZouQiang等[6]方法基础上，稍作修改。每种胶囊各取1g置于无菌玻璃葡萄糖瓶中，用胶塞和铝盖封口，贮藏于4℃。分别于第7、14、21、28天取出，添加9mL解囊液，振摇10min至完全解囊，计数方法见1.3.6节。
1.3.10COS涂层的益生元效应验证
为确保长双歧杆菌含量大致相同，准确称量(0.2000±0.0005)g的基础微胶囊，分别浸入2mL不同质量浓度(1、3、5mg/mL)的COS溶液中，涂覆方法见1.3.4节。过滤收集微胶囊，并加入1.8mL无菌解囊液充分混合10min，使微胶囊完全液化。取1mL液化液进行活菌计数，方法见1.3.6节。另取1mL液化液全部注入50mLMRS肉汤中，37℃厌氧培养40h。每小时取培养液，稀释适当的倍数后，在96孔板中用酶标仪在600nm波长处测量细菌的光密度。
1.3.11动物分组及处理方案
1.3.11.1微胶囊在体内的解囊效果实验
参照Würth等[18]方法，将8周龄健康成年雌性SPF小鼠(未禁食)分别用3种新鲜微胶囊的悬浮液灌胃(微胶囊用量200mg/只)，于灌胃后5min和1、3、5、7h处死小鼠。纵向剖开小鼠的胃、小肠、盲肠和结肠，各取内容物0.1g加入0.9mL无菌生理盐水涡旋均匀。用筛绢滤去毛发和食物残渣等大颗粒杂质，然后用显微镜分析微胶囊的存在与否。
1.3.11.2微胶囊对小鼠肠道菌群的调节作用实验
在Kushal等[19]方法基础上，稍作修改。将60只8周龄健康成年雌性SPF小鼠随机分成5组，每组12只。所有小鼠均可自由获取水和正常饲料。用生理盐将游离的长双歧杆洗涤并菌重悬，调节菌浓度至109CFU/mL。经体外计数，基础微胶囊、COS-微胶囊和AOS-COS-微胶囊中包埋的长双歧杆菌数均约为109.5CFU/g，加入或外包海洋寡糖不影响包埋产率。将3种微胶囊各3g分别悬浮于10mL无菌生理盐水中，得到的微胶囊悬浮液中长双歧杆菌的浓度约为109CFU/mL。每天早晨对每只小鼠进行称质量并灌胃，每日灌胃菌液或微胶囊悬浮液的体积约为小鼠当天体质量的1/100。第1组(空白对照组)灌胃无菌生理盐水;第2组(阳性对照组)灌胃长双歧杆菌菌液;第3组(基础微胶囊实验组)灌胃基础微胶囊悬浮液;第4组(COS-微胶囊实验组)灌胃COS-微胶囊悬浮液;第5组(AOS-COS-微胶囊实验组)灌胃AOS-COS-微胶囊悬浮液。灌胃持续21d，在最后一次灌胃后24h(使未定植于小鼠肠道或已失活的长双歧杆菌被小鼠排出体外)处死小鼠，取结肠内容物。
1.3.12小鼠肠道菌群分析
从每组中随机各选择3只小鼠结肠内容物样本各0.1g，于0.9mLPBS(0.1mol/L，pH7.0)中涡旋至均匀。滤去食物残渣及毛发等大颗粒杂质，将溶液梯度稀释后涂布于莫匹罗星锂盐改良MRS琼脂上，37℃厌氧培养72h并计数。
从每组中随机各选择3只小鼠结肠内容物样本，干冰条件下送往北京奥维森基因科技有限公司。完成基因组DNA抽提后，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测。针对16SV3-V4区域合成带有barcode的特异引物。采用TransGenAP221-02：TransStartFastpfuDNAPolymerase对基因组进行PCR扩增，每个样本3个重复，将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物，Tris-HCl洗脱。采用IlluminaMiSeq测序技术进行测序。原始数据下机后，对测得的PEreads进行质控和过滤，然后根据PE测序的overlap关系将成对的序列拼接成一条序列。用QiimeVersion1.8将97%的相似水平下的序列划分为一个可操作分类单元(operationaltaxonomicunit，OTU)，进行α多样性分析及菌群构成分析。
1.4数据处理与分析
使用Origin8.6作图。所有实验重复3次，使用SPSS22.0通过One-wayANOVA分析数据并表示为±s。P<0.05，差异显著。
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