摘要：农药、兽药、重金属、生物毒素等残留物质的痕量检测在医学诊断、食品安全、环境监测等领域均具有重要意义，其中基于抗原-抗体特异性识别的免疫分析技术具有特异性强、灵敏度高、稳定性好、操作简便快捷等优点，但如何获得小分子化合物的特异性抗体是研制免疫分析技术的关键。作者介绍了基于杂交瘤技术制备小分子化合物单克隆抗体的方法，分析了影响杂交瘤技术制备小分子化合物单克隆抗体的因素，然后综述了小分子化合物单克隆抗体在兽药残留、药物开发、环境保护等动物医学领域的应用，最后展望了小分子化合物单克隆抗体生产和应用的发展趋势，为小分子化合物单克隆抗体的制备与应用相关研究提供指导。
关键词：小分子化合物;痕量检测;单克隆抗体;影响因素;兽医临床
小分子化合物主要是指相对分子质量在5000以下的化合物[1]，如农药、兽药、重金属、生物毒素等。其在食品、水体和环境中的残留严重威胁着人类健康和环境安全，因此它们的痕量检测对医学诊断[2]、食品安全[3-4]、环境监测[5-6]等领域均有重要意义。气相色谱法和液相色谱法具有很高的灵敏度和较好的集成检测优势，是目前应用最广泛的小分子化合物的检测方法[7]。但这些检测方法需要进行复杂的样品前处理，且检测过程繁琐，依赖价格昂贵的精密仪器和专业技术人员[8]。作为仪器分析法的补充，近年来基于抗原-抗体特异性识别的免疫分析方法，如胶体金免疫层析技术、竞争性酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫电化学分析技术等，在小分子化合物的残留分析中得到了迅速的发展，表现出特异性强、灵敏度高、线性范围宽、性噪比低等优点[9]。
特异性抗体是免疫分析方法的基础，决定了免疫分析方法和相关产品的性能和质量，因此如何获得高质量的小分子化合物单克隆抗体尤为重要。作者介绍了基于杂交瘤技术的小分子化合物单克隆抗体制备方法，分析了杂交瘤技术中影响小分子化合物单克隆抗体生产的因素，最后展望了小分子化合物单克隆抗体在动物医学领域的应用前景。
1小分子单克隆抗体的制备
由于小分子化合物的相对分子质量通常低于5000，具有免疫反应性而不具备免疫原性，因此如何获得用于这些小分子化合物免疫分析的特异性抗体是研制该技术的关键。用于免疫分析的抗体主要有多克隆抗体、单克隆抗体和纳米抗体等，其中单克隆抗体具有特异性强、性质均一、易于大量生产等特点，被广泛应用于环境监测、疾病诊断、生物医学研究等领域[10]。单克隆抗体制备方法有很多种，目前常用的主要有基于小鼠或兔子的杂交瘤技术和基于噬菌体抗体展示库和构建免疫抗体噬菌体展示库的抗体筛选技术。其中，杂交瘤技术是较早出现和目前使用较为广泛的单克隆抗体制备方法。
由于小分子化合物通常属于半抗原，无法直接刺激动物机体产生抗体，因此需要与大分子物质(如蛋白质)作为载体与之偶联成为完全抗原，才能刺激人体或动物机体产生免疫应答，产生特异性抗体[11]。基于杂交瘤技术的单克隆抗体制备大致流程包括免疫动物、细胞融合、选择性培养、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化等步骤，由于整个过程所涉及的材料以及操作技术均较多，因此在完全抗原的设计与合成、动物免疫、细胞融合、细胞筛选、腹水制备或细胞培养、抗体纯化等每一步都可能影响最终抗体的产量与质量。
1.1小分子化合物完全抗原的合成
小分子化合物主要是半抗原，只有反应原性，而缺乏免疫原性，需要将它们与蛋白质载体结合形成完整的抗原，以获得免疫原性，从而刺激动物机体产生抗体。半抗原的设计与制备取决于待检测物的分子结构，根据半抗原的化学结构与活性基团选择合适的载体[12]。一般来说，如果小分子化合物含有活性基团，则可以直接利用活性基团与载体蛋白通过化学偶连制备完全抗原;如果小分子自身没有可与蛋白载体共价连接的基团，则需要通过水解、氧化、还原等反应使小分子化合物带上羧基、羟基等活性基团，才能进一步与载体蛋白进行化学偶联。如果小分子化合物没有能够直接连接到载体的共价基团，并且小分子化合物的衍生物可能损害其免疫特性，那么小分子化合物的中间体也可用于合成含有降解产物或代谢物的半抗原。如Kee等[13]以砒石坐环替代τ-pHis中的咪唑环，合成磷酸化组氨酸结构类似物pPye，再与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联后成功制得效价更好的抗体。
根据小分子化合物活性基团的不同，可用碳二亚胺法、戊二醛法、重氮化法、混合酸酐法、活性酯法、物理法等方法偶联载体蛋白和小分子化合物，制备完整抗原。如果半抗原含有氨基，则可采用碳二亚胺法、混合酸酐法和活性酯法将其与载体蛋白的氨基进行偶联。通常先将含羧基的半抗原分子与碳二亚胺反应活化小分子化合物上的羧基后，再在反应体系中加入载体蛋白，使小分子化合物与载体蛋白之间通过羧基与氨基的缩合反应发生偶联，同时减少载体蛋白之间的相互偶联。因碳二亚胺法操作简单，是很多学者普遍采用的小分子化合物完全抗原制备方法[14-16]。在混合酸酐法中，先将含有羧基的半抗原与氯甲基异丁酯反应形成活泼中间体混合酸酐，然后与蛋白质载体上的氨基反应形成肽键，实现小分子化合物与载体蛋白的共价连接。活化酯法通过使含有羧基的小分子化合物在二环己基碳二亚胺(DCC)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的作用下生成活泼酯衍生物，再与载体蛋白上的氨基反应形成酰胺键，从而实现小分子化合物与载体蛋白的偶联[17]。对于含有氨基的小分子化合物，多通过戊二醛法与重氮法将其与载体蛋白偶联。戊二醛法通过自身的2个功能醛基分别与半抗原和载体蛋白上的氨基形成schiff键而实现小分子化合物与载体蛋白的偶联，其与碳二亚胺法类似，偶联反应比较温和，对缓冲溶液和pH要求不高[18-21]。李颖等[22]采用戊二醛法将半抗原苦参碱与载体蛋白BSA、卵清白蛋白(OVA)进行偶联合成了苦参碱的人工抗原，免疫新西兰大白兔获得的多克隆抗体效价达到了128000。重氮法是以芳香族伯胺为原料，通过亚硝酸重氮化使小分子化合物生成芳胺重氮盐，再与载体蛋白发生共价偶联的完整抗原制备方法。韩占江等[23]用重氮化法将磺胺间甲嘧啶(SM1)与BSA偶联制备合成完全抗原BSA-SM1制备的完全抗原免疫BALB/c小鼠，获得了高效价的多克隆抗体，为SM1残留免疫学检测方法的建立奠定了基础。为了不破坏小分子化合物的结构，可利用离子相互作用和疏水作用将小分子化合物与载体蛋白进行连接的物理偶联法来制备完全抗原。刘成梅等[24]分别采用物理法和戊二醛法制备氨苄青霉素(AMP)人工抗原，发现物理法的偶联效率更高，操作更简便。
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制备的小分子化合物的完全抗原在进行动物免疫前，还需经过纯化和鉴定，具有高纯度和高稳定性的人工抗原才能用于后续试验。动物免疫法、电泳法[25]、薄层色谱法、光谱法、紫外扫描法、核磁共振法、质谱法等是比较常用的抗原鉴定方法。因其操作简便、成本低、准确率高等特点，动物免疫法、质谱法、光谱法是人工抗原鉴定的常用方法。胡骁飞等[26]通过凝胶电泳、动物免疫对合成玉米赤霉醇(ZER)人工抗原进行质量鉴定，间接ELISA法测定抗血清效价，间接竞争阻断ELISA法测定抗血清的敏感性和特异性，最后测定血清效价，验证了抗原的质量。
1.2动物免疫
纯化鉴定的小分子化合物完全抗原可直接免疫动物制备多抗血清或杂交瘤细胞生产单克隆抗体。常用的动物有鼠、兔、鸡、山羊等，其中新西兰大白兔主要用于制备多克隆抗体，而BALB/c小鼠则多用于提供B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融和制备杂交瘤细胞。为了增强免疫效果，通常将抗原与免疫佐剂混合。此外，1次免疫很难得到所需数量的B淋巴细胞，因此常需要多次加强免疫。以BALB/c小鼠为例，第1次免疫采用皮下多点注射，注射前将小分子化合物完全抗原与弗氏完全佐剂等体积充分乳化;第1次免疫15d后，用同样剂量的小分子化合物完全抗原和弗氏不完全佐剂混合后，通过皮下多点注射加强免疫1次;隔2周再用同样方法，加强免疫1次。每次免疫结束后1周，采集小鼠血清，用ELISA法测定抗体滴度，只有达到预定滴度的小鼠，才可进行B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合。融合前3d采用腹腔或静脉注射的方式以同样剂量的人工完全抗原加强免疫1次。
1.3杂交瘤细胞的制备与筛选
B淋巴细胞可以产生抗体，但不能在体外繁殖或长期培养，骨髓细胞可以在体外无限期生长，但不能产生抗体。1975年Kohler和Mistein发明了细胞融合技术[27]，将B淋巴细胞和骨髓细胞融合成杂交瘤细胞，杂交瘤细胞在体外生长迅速，不断形成单克隆抗体，广泛应用于高纯度、高特异性的单克隆抗体制备。杂交瘤细胞的主要制备流程：①取小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞按脾细胞和骨髓瘤细胞10∶1的比例混合，离心后弃上清，然后加入聚乙二醇诱导细胞融合;②将融合细胞用含HAT的培养基在96孔板中培养，并在培养一段时间后，使用放射免疫测定法(RIA)、ELISA、免疫荧光试验(IFA)、间接血凝试验(IHA)等方法测定各细胞培养孔上清中的抗体分泌情况，筛选分泌特异性抗体的阳性细胞;③采用有限稀释法或半固体培养法筛选分泌抗体的单克隆杂交瘤细胞，扩增培养后适当保存[28]。
1.4抗体生产与纯化
为了获取大量目标单克隆化抗体，需要对杂交瘤进行扩大培养，大量制备单克隆抗体的方法主要有体外培养法和体内诱生法。在体外培养法中，杂交瘤细胞在培养瓶或培养罐中进行培养，在培养过程中，通过收集并纯化培养液中的抗体获得杂交瘤细胞分泌单克隆抗体。体外培养法得到的抗体杂质少，易于纯化，但此方法产量低，一般培养液内抗体含量仅为10～60μg/mL，如果大量生产，费用较高。近年来出现的多种新型细胞培养技术和培养装置有效提高了杂交瘤细胞体外培养的效率和抗体产量，使得该方法应用范围越来越广[29]。体内诱生法包括实体瘤法和腹水法，其中实体瘤法是将对数生长期的杂交瘤细胞接种于小鼠背部皮下，待肿瘤达到一定大小后采血，从血清中获得单克隆抗体，而腹水法则是将杂交瘤细胞直接注射到预先用降植烷或液体石蜡处理的小鼠腹腔中，一段时间后收集腹水，从腹水中获得抗体[30]。实体瘤法血清中抗体含量可达到1～10mg/mL，但采血量有限，腹水法腹水量大抗体浓度高，但抗体纯化相对复杂[31]。不管用何种方法制备的单克隆抗体都可能含有杂质，通常需要进一步纯化和鉴定，常用的单克隆抗体纯化方法主要有辛酸-硫酸铵沉淀法、色谱法、吸附法等[32]。
2影响小分子化合物单克隆抗体生产的因素
由于杂交瘤技术制备单克隆抗体的周期长，步骤的多重性和操作的复杂性，许多因素都会影响目标抗体的质量和产量。最常见的影响因素有蛋白载体的类型、佐剂的应用、免疫程序的制定、单克隆抗体的纯化等。
2.1载体蛋白
BSA、人血清白蛋白(HSA)、兔血清白蛋白、OVA、匙孔血蓝蛋白(KLH)、甲状腺球蛋白、纤维蛋白原、明胶、分工合成多聚肽(如多聚赖氨酸PLL)等是小分子化合物偶联制备完全抗原的常用载体[33]。BSA具有稳定的理化性质，不易变性，廉价易得，分子中有许多自由氨基，具有很强的溶解性。在含有有机溶剂(如吡啶、N，N-二甲基甲酰胺等)的情况下都能与半抗原进行偶联，是最常用的载体蛋白。相似的还有HSA、兔血清白蛋白和OVA等，常用于不同的免疫动物。KLH是一种高免疫原性的蛋白质大分子，存在于某些软体动物和节肢动物的血淋巴液中，常作为制备免疫原的载体蛋白，KLH与脊椎动物的免疫系统具有良好的异源性，被认为是首选载体，但其价格昂贵，且会激发大量的针对KLH自身抗原决定簇的B淋巴细胞克隆，目前应用相对较少。Isa等[34]将KLH与环氧糖核酸素进行偶联作为抗原和KLH同时免疫绵羊，最后测得2种免疫抗体之间没有显著差异。总得来说，在选择载体蛋白时，需综合考虑载体的分子量、活性基团、溶解度、来源、价格等因素[35]。
2.2佐剂
免疫佐剂是一种能够改变或增强生物体特异性免疫反应的物质，能够改善相应抗原的免疫原性或改变免疫应答的类型，在获得高免疫效应和足够数量的单克隆抗体方面起着非常重要的作用。作为油型乳剂的代表，弗氏佐剂可显著提高人工抗原的特异性免疫应答水平，被广泛应用于以试验为目的的研究，但弗氏佐剂中含有石蜡油、羊毛脂等物质进入动物体内不易代谢，故不能用于疫苗的制备[36]，多用于单克隆抗体制备过程中以提高腹水产量。新型免疫佐剂有免疫刺激复合物佐剂、CpGODN佐剂、脂质体佐剂、纳米佐剂等，这些佐剂的水溶性特征使其对动物的刺激较小更符合动物福利，无需进行乳化操作即可取得良好的免疫效果，且获得的单克隆抗体的灵敏度和特异性与通过弗氏佐剂制备的相似[37]，但这些新型佐剂的应用和推广仍需进一步验证。
2.3免疫程序
免疫程序是单克隆抗体制备过程中重要的一个环节，恰当的免疫程序可有效刺激B淋巴细胞的增殖、分化和成熟，有利于细胞融合形成杂交瘤细胞，并增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤细胞的机会。因此，在设计免疫方案时，应充分考虑抗原纯度、免疫途径、免疫周期、佐剂以及动物对抗原的反应能力等因素。如，与佐剂充分混合的小分子化合物完全抗原可通过静脉注射、皮下注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、淋巴结注射等多种途径免疫动物。Namvarpour等[38]通过研究3种不同免疫途径检测小鼠细胞免疫水平，结果表明3种免疫策略中都产生有效的免疫刺激因子，但鼻腔给药倾向于增强机体的细胞免疫反应。为减轻动物不适和增强免疫效果，通常采用多途径免疫，但一次不应超过2种途径。在选择免疫系统时，要考虑免疫系统的理化性质和动物的福利[39]，如弗氏完全佐剂的首次免疫通常是皮下注射，而使用弗氏不完全佐剂进行加强免疫时多采用腹腔注射。
2.4抗体纯化
由于从细胞培养上清、免疫动物血清或腹水中得到的抗体中含有许多杂蛋白和化合物等杂质成分，这些杂质成分不仅可能使抗体容易失活，也严重影响抗体的应用，因此需要对收集到的抗体尽快进行纯化。饱和硫酸铵法、色谱法和吸附法是抗体纯化的常用方法。辛酸硫酸铵沉淀法在偏酸条件下，可以沉淀腹水或血清中除IgG外的蛋白质，一般此法不用于IgA和IgM的纯化。赵洪哲等[40]将能够稳定分泌牛病毒性腹泻病毒特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞接种到BALB/c小鼠后，利用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水中的抗体，得到纯度较高的单克隆抗体。此法因具有操作简单，抗体回收率高，产率高以及能够保持良好活性等优点被广泛应用于IgG1和IgG2b的纯化。但该方法只能将所有的抗体从血清中分离出来，不能区分抗体的识别特性，而载体蛋白亲和纯化能识别载体蛋白的抗体组分，全抗原亲和纯化则能直接将小分子化合物的特异性抗体组分分离出来。色谱法是利用混合物中各组分的不同理化性质，使各组分在固定相和流动相中有不同程度的分布，由于每个组分在流动相中通过固定相的速度不同，从而达到了分离各组分的目的[41]。Wang等[42]制备出含有氯胺酮单克隆抗体的小鼠腹水，并用色谱法进行纯化，最高纯度达到97.6%。虽然此法纯化效率高，回收率高，但色谱法存在易使抗体失活，成本昂贵等缺点。吸附法的原理是对抗原抗体的特异性吸附，但与免疫亲和层析法不同，它是一种非层析技术，通过将目标抗体与具有多个抗体结合位点的抗原形成二聚体、三聚体或多聚体环状物，然后根据分子质量的不同用化学方法使环状物沉淀，最后将抗体释放而使抗体纯化，该法操作简便、快速、廉价，且产量高、纯度高。然而该方法也存在缺陷，即抗原必须具有多个抗体结合位点。纯化方法虽多，但是要在使用时根据具体情况，找到最适合的纯化方法才能取得好的分离效果。——论文作者：杨松鑫1，冯建远2，郭旋2，韦柳源1，梁翼莹1，严昊1，张子仪1，陈海兰1*
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