【摘要】目的探讨聚柠檬酸复合纳米羟基磷灰石(POC-Click-HA)制作的新型生物可吸收松质骨螺钉治疗比格犬股骨外髁骨折的生物相容性及生物力学特性。方法健康成年比格犬9只，雌雄不限，体重8~11kg，制备双侧股骨外髁骨折(AO分型33.B1型)模型。右侧采用POC-click-HA可吸收松质骨螺钉固定，作为实验组;左侧采用聚消旋乳酸PDLLA可吸收松质骨螺钉固定，作为对照组。术后观察实验动物一般情况，分别于术后4周、8周、12周处死3只动物，取材行大体观察、Lane-Sandhu组织学评分及生物力学分析。结果实验动物均存活至实验完成。大体观察两组骨折无移位，均于12周愈合，POCclick-HA组螺钉可见有新生骨组织从螺钉表面向内部生长。术后3个时间点对骨折部位进行LaneSandhu组织学评分，两组螺钉之间无统计学差异(P>0.05)。生物力学测试，4周POC-click-HA组钉-骨界面最大载荷低于PDLLA组(P<0.05)，8周和12周两者无显著差异(P>0.05)。结论POC-click-HA松质骨螺钉具有良好的生物相容性，生物力学性能满足固定比格犬股骨外侧髁B1型骨折。
【关键词】可降解骨螺钉;股骨外髁骨折;柠檬酸;生物相容性;生物力学
目前临床应用的金属材料(不锈钢、钴合金、钛合金等)具有需二次手术取出金属内固定材料、应力遮挡作用及在体内释放金属离子等缺点[1~5]，而以聚乳酸(polylacticacid，PLA)、聚乙醇酸(polyglycolic，PGA)为代表的可降解吸收的高分子生物材料也存在自身的缺点：降解速度与新生骨生成速率不一致，降解产物多数呈酸性，长期在体内蓄积会导致局部PH值降低，进而造成迟发性无菌性炎症、钉道周围骨溶解等并发症[6~8]。研究表明，作为三羧酸循环中间产物之一的柠檬酸(citricacid)，在骨组织固有成分中占5%，且人体90%以上柠檬酸分子存在于骨中;天然骨磷灰石纳米晶体表面的柠檬酸酯与磷灰石、胶原蛋白紧密结合，这些含柠檬酸的有机基质在调节磷灰石纳米晶体的厚度，控制骨的强度及骨应力传导中起重要作用[9~13]。受此启发，本实验室与美国宾夕法尼亚大学材料与生物技术研究室的杨健教授团队协作，合成一系列基于柠檬酸的可降解骨生物仿生材料，并在动物与细胞模型中验证了这些材料具有良好的骨融合与骨诱导性能[14~18]。本实验利用前期合成的柠檬酸多聚体与纳米羟基磷灰石复合高分子材料Poly(octanediolcitrate)-click-Hydroxylapatite(以下简称POC-Click-HA)制作全螺纹松质骨螺钉，用于比格犬股骨外髁骨折(AO分型33B1型)固定，同时使用同等规格的已应用于临床的聚消旋乳酸高分子Poly(DLlactide)(以下简称PDLLA)全螺纹松质骨螺钉作为对照，研究其固定骨端骨折的可行性、评估其生物相容性及生物力学性，为进一步研发新型内固定材料提供思路。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物成年比格犬9只，雌雄不限，体重8~11kg，单笼喂养，由中山大学实验动物中心(东校区)提供。实验动物生产许可证：SCXK(粤)2011-0029;使用许可证：SYXK(粤)2011-0112。
1.1.2实验器材(1)可吸收POC-click-HA松质骨螺钉。自行制备。电脑绘制螺钉草图，将数据导入机械加工软件，连接数控机床，经过车外圆、车外形、车螺纹、去毛剌等工序，获得POC-click-HA松质骨螺钉，直径5.5mm，全长55mm，螺纹长50mm，初始强度>60Mpa，其弹性模量与松质骨相当。包装好以钴60辐射灭菌备用[17]。(2)可吸收骨折内固定聚消旋乳酸(PDLLA)螺钉。成都迪康中科生物医学材料有限公司生产，环氧乙烷灭菌消毒。规格同上。(3)螺钉配套器械：推进器、螺丝刀、测深尺、埋头器、钻头、丝锥。
1.2实验方法
1.2.1手术腹腔注射3%戊巴比妥钠(1ml/kg)进行麻醉生效后，取侧卧位将比格犬固定在手术操作台上，备皮，常规消毒，铺无菌手术孔巾。自右膝关节外侧入路，作一纵形手术切口，逐层切开暴露至关节囊(保留髌韧带)，将髌骨向膝关节内侧推移使其脱位，进一步暴露股骨内、外髁。使用微型电锯自上向下锯断股骨外髁(注意保留前后交叉韧带)，造成比格犬股骨外髁骨折模型(AO分型为33.B1型)。巾钳复位骨折后，以直径4.5mm钻头自股骨外侧向内侧钻孔，攻丝、测深后使用POC-click-HA松质骨螺钉固定骨折，螺钉穿透对侧皮质。生理盐水和碘伏充分冲洗后，逐层关闭切口，无菌敷料包扎，腿部管形石膏固定。同法，造左侧股骨外髁骨折模型，以同等规格PDLLA螺钉固定骨折，见图1。术后单笼喂养，术后第1~3d予肌肉注射青霉素钠160万单位/次/日预防感染。
相关期刊推荐：《中国临床解剖学杂志》(双月刊)创刊于1983年，由中国科学技术协会主管，中国解剖学会主办，南方医科大学承办。旨在加强解剖学基础理论研究与临床实践工作紧密结合，以促进现代临床医学的发展，侧重发表与临床应用密切相关的应用解剖学、实验形态学、临床生物力学等方面的学术论著。
1.2.2主要观察指标(1)一般情况及标本大体观察：观察比格犬术后的精神状态、行走步态、饮食及切口愈合情况(伤口有无开裂、感染、窦道形成等)。(2)术后4周、8周、12周处死3只动物切取标本，对大体标本进行观察并进行骨折部位Lane-Sandhu组织学评分。(3)生物力学测试：测试地点为南方医科大学系统解剖学实验室，生物力学测试机器为BoseElectroforce，将标本置于测试平板上，平板固定于机器底座。取直径5mm的金属棒垂直对准松质骨螺钉，使用计算机控制金属棒从上往下移动，推顶螺钉，电脑同步测量并记录推出螺钉的最大力量，即为界面应力最大载荷。
1.3统计学方法
采用IBMSPSSStatistics18.0统计软件分析处理。计量资料统计描述用均数±标准差(Mean±SD)表示。不同组间术后3个时间点的比较采用析因方差分析法。P<0.05表明具有统计学差异。
2结果
2.1大体情况
2.1.1动物一般情况实验动物均存活至实验完成。术后精神、食量、活动量逐渐恢复，1周后即可缓慢步行，4~6周后行走步态基本正常;伤口均愈合良好，未见明显红肿、脓液渗出、窦道形成等术后并发症。
2.1.2标本观察术后按时间点取材，由标本可见两组骨折均固定牢固，无明显移位。两组螺钉螺帽周围均有纤维结缔组织包裹，无充血、水肿及化脓等，关节面结缔组织不多，较为平整。骨折愈合情况：4周骨折线清晰可见，骨折缝隙内充满白色纤维组织;8周骨折稍模糊，骨折缝隙内仍有较多白色纤维组织;12周骨折线更为模糊，部分缝隙内有少量纤维组织，有的甚至完全吸收，符合骨折愈合标准。矢状位截面可见，术后12周与术后8周相比，螺钉与周围骨组织结合更为紧密，POC-click-HA组部分有新生骨组织从螺钉表面向内部生长(图2)。
2.2Lane-Sandhu组织学评分
术后3个时间点对骨折部位进行Lane-Sandhu组织学评分，结果显示：组内各时间点评分差异有统计学意义(P<0.05)，说明随着时间推移，两组骨折被螺钉固定后均表现出良好的愈合。但在术后3个时间点两组螺钉分别进行对比，评分均无统计学差异(P>0.05)，说明POC-click-HA螺钉与PDLLA螺钉固定对骨折愈合效果无明显差异(图3)。
2.3螺钉-骨界面应力载荷测试结果
使用生物力学测试机对两组螺钉术后3个时间点的螺钉-骨界面最大应力载荷进行测量。两组螺钉各自组内对比：两组均显示组内术后3个时间点的钉-骨界面最大应力载荷有差异，具有统计学意义(P<0.05)，说明随着时间增长，螺钉与骨组织结合得更紧密。组间对比：将术后每个时间点测得的PDLLA组与POC-click-HA组螺钉-骨界面最大应力载荷进行对比，结果显示4周PDLLA组载荷高于POC-click-HA组，具有统计学差异(P<0.05);8周和12周，两组钉骨界面载荷对比无统计学差异(P>0.05)，说明内固定初期POC-click-HA螺钉固定强度不及PDLLA螺钉，但到了后期二者固定强度无明显差别(图4)。
3讨论
3.1POC-click-HA骨螺钉的生物相容性
本组前期研究合成多孔隙的柠檬酸组织工程支架材料与骨髓间充质干细胞(BMSC)进行共培养，发现该POC-click-HA材料支架为BMSC细胞的粘附提供了良好的附着点，BMSC细胞活性良好，能进一步生长和分化，证明此类聚柠檬酸复合生物材料的生物相容性和生物安全性[14~18]。在本实验，POC-click-HA松质骨螺钉组比格犬切口未见红肿、感染、缝线开裂，无窦道形成，术后12周未见迟发性炎症反应、钉道周围骨溶解等并发症，而且在后期可以看到螺钉和骨较好整合，说明POC-click-HA骨螺钉材料在中长期内对周围组织无明显刺激，不引起异物排斥反应，无毒性。
3.2POC-click-HA骨螺钉的生物力学强度
生物力学强度测试得到的螺钉-骨界面应力实际上由两种结合力量构成-机械结合力和生物结合力[19]。前者指螺钉与骨组织之间的把持和嵌合力，在内固定初期意义重大;后者指随着时间推移，螺钉与骨组织整合的力量，在内固定后期发挥更重要的作用。POCclick-HA螺钉的局限在于机械结合力稍弱，因此术后4周测得的螺钉-骨界面最大应力载荷低于PDLLA螺钉，推测原因有两点：第一，PDLLA螺钉植入骨组织后会产生自身径向膨胀效应而更牢固地把持骨组织，POC-click-HA螺钉不具有这种特性;第二，与POCclick-HA螺钉螺纹的分布、深度、间距等设计有关，进一步改善螺钉有望获得更好的把持力。而术后8周、12周测得的螺钉-骨界面最大应力载荷两组螺钉接近，原因可能是POC-click-HA螺钉具有很强的骨诱导能力和更好的降解性，使新生骨矿化并产生骨小梁，快速地与周围骨组织发生整合，产生较强的生物结合力。因此能弥补机械结合力的不足，在术后8周和12周表现出不逊于PDLLA螺钉强度的界面应力载荷。
3.3POC-click-HA骨螺钉的优缺点
现用于临床研究的生物可吸收材料主要有多聚乙醇酸(PGA)和多聚乳酸(PLA)。由于PGA降解后产生酸性产物，降低周围组织pH值，引起骨溶解、异物反应、无菌性骨囊肿等不良事件，而且螺钉机械强度下降过快，临床已很少使用;PLA是目前临床应用最广泛的可吸收材料[20]。王毅等[21]采用PDLLA可吸收舟骨螺钉在标本内的抗弯曲、抗拉伸强度及固定骨折的实际效果观察，认为该螺钉对手舟骨腰部骨折的固定效果较克氏针更理想，是一种可行的手舟骨骨折固定材料。秦金桥等[22]研究认为PDLLA混合壳聚糖可吸收髓内钉在多指再植指骨固定方面较克氏针有明显的优势。还有研究表明PLA螺钉在踝关节骨折、下胫腓骨联合损伤中应用取得良好临床效果[23,24]。但PLA降解时间长，不利于促进骨生长的细胞粘附限制了它的应用[20]。而POC-click-HA材料最大优点是具有和骨组织相同成分的柠檬酸，还具有诱导成骨的作用[14~18]，因此它的组织相容性更好，从图2可见POC-click-HA螺钉与骨组织整合更强，术后12周已部分降解融合，这也是术后8周和12周两组钉-骨界面载荷对比无显著差异的原因(图3)。但POC-clickHA螺钉的缺点是初始生物力学强度较PDLLA螺钉弱，对骨折早期固定缺乏加压作用，表现为4周时POC-click-HA钉的载荷低于PDLLA组(图4)。
总而言之，POC-click-HA螺钉在本实验过程中表现出良好的生物相容性，且具有一定力学强度，对于比格犬股骨外髁B1型骨折具有较好的内固定作用。本组下一步的工作是通过影像学和组织学进一步评估POC-click-HA螺钉在体内的降解性及诱导成骨性，并探讨其作用机制，进而优化材料的组成和结构，增强力学强度，使其能成为一种新型的可吸收骨折内固定材料。——论文作者：杨诚1，李祯2，廖坚文1，樊仕才1，杨健3，白晓春4
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