摘要为优选出高含量的莽草酸银杏落叶资源，建立了一种HPLC方法测定银杏落叶中莽草酸的含量。比较树上绿叶与落叶、不同胸径、雌株与雄株、不同采集时间、不同地区等5个条件下莽草酸的含量差异。结果表明莽草酸浓度在0.04~0.15mg/mL范围内线性关系良好(r>0.999);平均加样回收率为99.21%(N=6，RSD=1.35%)。不同采集条件下银杏落叶中莽草酸的含量规律如下：银杏落叶中莽草酸的含量平均值大于树上绿叶;落叶中莽草酸的含量随着胸径的增加而增加，线性相关系数R2为0.673;雌株银杏落叶中莽草酸平均含量大于雄株;与不同采集时间以及不同地区之间未呈现出相关性。本实验建立的莽草酸HPLC测定方法快速、简便，专属性强，准确度高;银杏落叶中莽草酸含量变化有一定规律，结果可为其资源开发利用提供科学依据。
关键词银杏;银杏落叶;莽草酸;高效液相色谱;含量测定
银杏(GinkgobilobaL.)为银杏科银杏属大型落叶乔木，广泛分布于中国、日本、朝鲜、韩国、加拿大、新西兰、澳大利亚、美国、法国、俄罗斯等国家和地区[1]。银杏叶中含有黄酮、萜内酯、酚酸、聚异戊烯醇等化学成分[2];具有活血、抗炎、止痛、抗氧化、抗病毒、降血脂、抗抑郁等作用[3-6];对高血压、脑功能障碍、动脉粥样硬化、扩张脑血管和其他血管疾病具有显著疗效[7-11]。目前的研究与开发主要集中于银杏叶中具有很强药理活性的黄酮类和内酯类成分。
经本课题组前期研究和查阅文献发现，在银杏落叶中有着丰富的莽草酸资源，适合工业化开发[12-13]。莽草酸是抗亚洲禽流感病毒药物“达菲”的重要成分，具有抗菌、抗肿瘤作用、防止血栓的形成、抗禽流感作用，市场的需求量较大[14-17]。目前对银杏落叶中莽草酸资源的关注度不够，研究内容较少，造成了莽草酸资源的浪费。在此背景下，本实验用高效液相色谱法测定5个条件下的银杏落叶中莽草酸的含量，找出银杏落叶中莽草酸的含量规律，以期对莽草酸资源的合理利用提供参考。
1仪器与试剂
1.1仪器
Waters2695/2996高效液相色谱仪、KQ-250B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)、电子天平(龙腾电子)、HH-S6数显恒温水浴锅(江苏金怡仪器科技有限公司)、回流冷凝管、圆底烧瓶、胶头滴管、烧杯、容量瓶、移液枪(100~1000μL)、2mL无菌注射器(上海康德莱企业发展集团股份有限公司)。
1.2实验试剂与材料
莽草酸对照品(成都普思生物科技有限公司)、石油醚(分析纯，天津市致远化学试剂有限公司)、无水乙醇(分析纯，成都金山化学试剂有限公司)，67批次银杏叶样品(四川成都样品采集时间为2020年11—12月，其余地区样品采集时间均为2020年11月下旬)分布详情见表1。
1实验方法
1.1对照品溶液的制备
精密称取莽草酸对照品适量，置于50mL容量瓶中，加入0.4%磷酸水溶液制成每1mL含0.2mg的对照品溶液。
1.2供试品溶液的制备
供试品均在45℃恒温条件下烘干，打粉，过五号筛，精密称取样品粉末1g，置于50mL圆底烧瓶中，加入15mL70%乙醇，称重，回流提取2h，放冷，称定质量，70%乙醇补重，石油醚等体积萃取，过滤，取续滤液1mL，定容至25mL容量瓶，微孔滤膜过滤，备用。
1.3色谱条件
Diamonsil(钻石)C18色谱柱(250×4.6mm，5μm);流动相为甲醇(A)-0.4%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱：0~10min，0%~2%A;10~15min，2%~90%A;15~18min，90%A;18~20min，90%~0%A;20~25min，0%A。流速为0.8mL·min-1;柱温为35℃;进样量为10μL;检测波长为220nm。
2方法学考察
2.1专属性试验
按“2.3”项下色谱条件进行检测，以莽草酸峰计算理论塔板数大于6000，分离度大于1.5。对照品及样品的色谱图见图1、图2。
2.2线性关系考察
精密吸取“2.1”项下的对照品溶液2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7.5mL，分别于10mL量瓶中，以甲醇定容。各取10μL注入液相色谱仪，测定，以对照品浓度(x，mg·L-1)为横坐标，峰面积y为纵坐标(y)，绘制标准曲线，并拟合线性回归方程，结果见表2，表明各化合物在相应线性范围内线性关系良好。
2.3仪器精密度试验
取适量“2.1”项下对照品溶液按液相色谱条件连续进样6次。莽草酸的峰面积RSD(N=6)分别为1.54%，结果说明仪器精密度良好。
2.4供试品溶液稳定性试验
随机抽取一份供试品，按“2.2”项下供试品溶液的方法制备，分别在0、4、8、12、16、20、24,、36h进样，记录峰面积，结果莽草酸峰面积的RSD(N=8)为1.27%，表明供试品溶液在36h内稳定。
2.5重复性试验
按“2.2”项下供试品溶液的方法，平行制备样品溶液6份，按上述方法测定，记录样品峰面积，莽草酸含量的RSD(N=6)为1.58%。结果表明本实验重复性很好。
2.6加样回收率试验
精密称取同一样品6份，每份0.5g，置50mL中，分别精密加入对照品8.06mg，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.2”项下色谱条件测定，记录峰面积，进样量10μL，计算回收率和RSD，结果见表3中所示。
2.7样品测定
精密称取银杏叶样品1.0g，按“2.2”项下样品溶液的制备方法进行制备，按“2.3”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，计算含量，实验数据以3个重复的“平均值±标准差”表示。不同分类条件的含量测定结果见表4、图3、图4、图5、图6(不同树木胸径、不同采集时间、树上绿叶与树下落叶、雄株与雌株等条件选取的样本均固定在四川成都地区)。
2.8产地系统聚类分析
采用IBMSPSSStatistics26统计软件以37批来自16个不同地区的样品中莽草酸的含量为变量，采用离差平方和瓦尔德(ward)法选取欧式距离平方和作为样本的测度，对37批样品进行系统聚类分析，结果见图7。
分析发现，当欧式距离为5时，37批样品被分成了三大类：第一类包括6，29，3，27，24，34，21，25，36，1，9，28，32，13，15，共计15个批次，这15批次的样品分别来自陕西西安，四川成都，北京西城，内蒙古呼和浩特，四川阿坝，云南昆明，广西玉林;第二大类包括2，26，12，14，23，4，33，7，10，37，11，这11个批次样品分别来自北京昌平，四川成都，贵州贵阳，广西柳州，宁夏银川，江苏苏州，浙江宁波，湖南湘潭;第三大类包括18，20，16，30，31，8，22，35，5，19，17，共计11个批次，这11个批次分别来自四川成都，江苏常熟，山东济南;当欧式距离为10时,37批样品被分成了2大类：第一类包括6，29，3，27，24，34，21，25，36，1，9，28，32，13，15，2，26，12，14，23，4，33，7，10，37，11，共计26批次，它们分别来自陕西西安，四川成都，北京西城，内蒙古呼和浩特，四川阿坝，云南昆明，广西玉林，北京昌平，贵州贵阳，广西柳州，宁夏银川，江苏苏州，浙江宁波，湖南湘潭;第二大类包括18，20，16，30，31，8，22，35，5，19，17，共计11个批次，分别来自四川成都，江苏常熟，山东济南。
由以上结果可以看出，聚类分析方法并没有将相同地区银杏叶中莽草酸的含量分为一类，并且同一类地区中莽草酸的含量在地理位置上不存在特征性规律。因此，可以认为，银杏叶中莽草酸的含量并没有呈现出地区性差异。
2.9相关性分析
相关分析用于研究定量数据之间的关系情况，是否有关系，关系紧密程度情况等，本研究利用SPSSAUV21.0数据科学分析平台，采用相关性分析方法，以莽草酸含量为变量，将雄株落叶与雌株落叶、不同银杏树胸径、银杏落叶与银杏绿叶、银杏落叶采集时间这四个条件进行相关分析，得到结果如表5、表6、表7、表8。
2.9.1银杏树雌株、雄株中莽草酸含量的相关性分析
由表5可以看出，银杏落叶与绿叶和银杏叶莽草酸含量之间的相关系数值为0.688，并且呈现出0.05水平的显著性，因而说明说明银杏雌株与雄株和含量之间有着显著的负相关关系。
2.9.2不同银杏树木胸径中莽草酸含量的相关性分析
由6表可以看出，银杏树木胸径和含量之间的相关系数值为0.820，并且呈现出0.05水平的显著性，因而说明树木胸径和含量之间有着显著的正相关关系。
2.9.3银杏落叶、银杏绿叶中莽草酸含量的相关性分析
由表7可以看出，银杏落叶与绿叶和含量之间的相关系数值为0.688，并且呈现出0.05水平的显著性，因而说明银杏落叶与绿叶和含量之间有着显著的正相关关系。
2.9.4银杏落叶采集时间的相关性分析
由表8可以看出，编号和含量之间的相关系数值为-0.681，接近于0，并且P值为0.205>0.05，因而说明采集时间和含量之间没有相关关系
2.10线性回归分析
回归分析是确定两种或两种以上变量间相互依赖的定量关系的一种统计分析方法，它的实质就是研究X(自变量,通常为量数据)对Y(因变量,定量数据)的影响关系情况,有相关关系不一定有回归影响关系。本研究利用SPSSAUV21.0数据科学分析平台，采用线性回归分析法，以莽草酸含量为变量，将雄株落叶与雌株落叶、不同银杏树胸径、银杏落叶与银杏绿叶、银杏落叶采集时间这4个条件进行回归分析，得到结果如表9、表10、表11、表12。由于雄株落叶与雌株落叶、银杏落叶与银杏绿叶这两个条件中的数据存在模型共线性问题，对以上两个条件进行逐步回归分析。
2.10.1银杏树雌株、雄株中莽草酸含量的逐步回归分析
将银杏树雄株、雌株作为自变量，而将莽草酸含量作为因变量进行逐步回归分析，经过模型自动识别，最终余下银杏树雌株一共1项在模型中，模型公式为：莽草酸含量=12.326+9.698*银杏树雌株，R方值为0.640，意味着银杏树雌株可以解释莽草酸含量的64.0%变化原因。而且模型通过F检验(F=17.780，P=0.002<0.05)，说明模型有效。银杏树雌株的回归系数值为9.698(t=4.217，P=0.002<0.01)，意味着银杏树雌株会对莽草酸含量产生显著的正向影响关系。
2.10.2银杏落叶、银杏绿叶中莽草酸含量的逐步回归分析
将银杏落叶、银杏绿叶作为自变量，而将莽草酸含量作为因变量进行逐步回归分析，经过模型自动识别，最终余下银杏绿叶一共1项在模型中，模型公式为：莽草酸含量=19.918-8.402*银杏绿叶，R方值为0.473，意味着银杏绿叶可以解释莽草酸含量的47.3%变化原因。而且模型通过F检验(F=8.992，P=0.013<0.05)，说明模型有效。银杏绿叶的回归系数值为-8.402(t=-2.999，P=0.013<0.05)，意味着银杏绿叶会对莽草酸含量产生显著的负向影响关系。
2.10.3不同银杏树木胸径中莽草酸含量的线性回归分析
从表11可知，将银杏树木胸径作为自变量，而将莽草酸含量作为因变量进行线性回归分析，从上表可以看出，模型公式为：莽草酸含量=6.871+0.065*树木胸径，模型R方值为0.673，意味着银杏树木胸径可以解释莽草酸含量的67.3%变化原因。对模型进行F检验时发现模型通过F检验(F=8.232，P=0.046<0.05)，也即说明银杏树木胸径一定会对莽草酸含量产生影响关系，最终具体分析可知：树木胸径的回归系数值为0.065(t=2.869，P=0.046<0.05)，意味着银杏树木胸径会对莽草酸含量产生显著的正向影响关系。
2.10.4银杏落叶采集时间的线性回归分析
从表12可知，将采集时间作为自变量，而将莽草酸含量作为因变量进行线性回归分析，从上表可以看出，模型公式为：莽草酸含量=22.718-3.002*采集时间，模型R方值为0.464，意味着采集时间可以解释莽草酸含量的46.4%变化原因。对模型进行F检验时发现模型并没有通过F检验(F=2.596，P=0.205>0.05)，也即说明采集时间并不会对莽草酸含量产生影响关系，因而不能具体分析自变量对于因变量的影响关系。
3讨论
3.1提取溶剂的选择
经查阅文献[18-20]，考察了甲醇、水、70%乙醇三种提取溶剂，由于莽草酸极性较大，甲醇提取率较低，以水和70%乙醇为提取溶剂时，提取率相当。但水提液色谱峰背景较为复杂，不利于含量测定，70%乙醇提取莽草酸分离度高，重复性和回收率满足要求。因此，选用70%乙醇作为提取溶剂。
3.2检测波长的确定
文献报道测定莽草酸的吸收波长有210nm、213nm、215nm[19-22]。本试验发现在220nm波长下莽草酸出峰明显且干扰峰最少，分离度较高，故选择220nm作为检测波长。
3.3流动相及流速的选择
本实验对甲醇-0.4%磷酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液、乙腈-水三种不同溶剂系统进行考察。从峰分离情况、保留时间以及峰对称性等考虑，最终选择用甲醇-0.4%磷酸水溶液作为流动相。本试验发现流速为1mL/min时，色谱峰出现时间在5分钟左右，会受到溶剂峰的干扰，故将其流速调整至0.8mL/min。
3.4银杏落叶中莽草酸的含量规律
根据实验结果，归纳出以下规律：第一，银杏(雌株)落叶中莽草酸含量与胸径有着显著的正相关关系，随着银杏树木胸径的增加，莽草酸含量呈增长趋势。建议在选取莽草酸资源时，可以选择胸径较大的树木落叶进行开发，其莽草酸含量较为丰富;第二，随着秋冬季节时间的推移，落叶(雌株)中莽草酸含量虽然呈下降趋势，但统计学分析结果表明两者并不存在相关性;第三，雌性银杏落叶中莽草酸的含量大于树上绿叶中莽草酸的含量。银杏叶中莽草酸的含量与其中3-脱氧-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶、脱氢圭尼酸合成酶、莽草酸脱氢酶有关，从树上脱落，切断了莽草酸的下游生化反应，阻止了莽草酸进一步合成芳香族氨基酸[23,24];第四，莽草酸含量和雄株之间有着显著的负相关关系，银杏雄株中莽草酸平均含量低于雌株中莽草酸平均含量。有文献报道雌株中总黄酮的含量高于雄株，而黄酮类化合物正是由莽草酸途径和多酮化途径生物合成的产物[25,26];随着经度或纬度的降低，不同地区银杏落叶中莽草酸的含量并没有呈现出递减或者递增的趋势，未发现明显规律，也许是由于在进行采集时，没有严格控制采集时间、树木胸径、雌雄株等变量造成的，有待进一步研究。
4结论
本论文建立了一种银杏落叶中莽草酸含量测定的方法，并用于测定树上绿叶与落叶、不同胸径、雌株与雄株、不同采集时间、不同地区等5个条件下莽草酸的含量，最后采用多种统计分析方法对银杏落叶中莽草酸的含量进行统计分析。由统计分析结果可知，树上绿叶与落叶、不同胸径大小、雌株与雄株3个条件下银杏落叶中莽草酸含量具有一定规律。在收集不同产地样本时，个别样本的收集条件变量没有做到完全一致，无法得出规律性的结论，应当在后续的研究中严格控制胸径、雌株、收集时间等变量再进行比较研究。——论文作者：刘鹏付艺萱张旭超王晓玲
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