摘要：建立一种基于超高效液相色谱−串联质谱(UPLC-MS/MS)同时测定大麻植物中8种大麻素的方法.样品经甲醇提取后，采用CHIMADZUShim-packVeloxPFPP色谱柱，以20mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸缓冲液及乙腈为流动相进行梯度洗脱，电喷雾离子源正负离子多反应监测模式进行质谱分析，外标法定量分析大麻植物中的8种大麻素.8种大麻素在5～500μg/L线性范围内线性良好，检测限(limitofdetection，LOD)和定量限(limitofquantification，LOQ)分别为0.13～1.26μg/L和0.39～3.83μg/L，保留时间和定量离子峰面积的相对标准偏差分别为0.10%～0.43%和3.46%～13.41%.建立的UPLC-MS/MS技术的大麻素定量分析方法灵敏度高、重现性好、分析效率高，可用于检测大麻植物样品中的大麻素含量.
关键词：大麻植物;大麻素;超高效液相色谱-串联质谱法;含量
大麻(CannabissativaL.)是桑科大麻属植物，为一年生草本植物，高1～3m.根木质，茎直立，具纵沟，灰绿色，密被短柔毛，皮层富含纤维.根据美国国立卫生研究院的研究，大麻植物含有400多种化学成分.目前从大麻植株中已分离出70多种大麻素类化合物，其主要活性成分有四氢大麻酚(THC)、大麻二酚(CBD)及其前体大麻二酚酸(CBDA)、次大麻二酚(CBDV)、大麻酚(CBN)、大麻帖酚(CBG)和四氢大麻酚丙基同系物(THCV)等.THC可由其前体四氢大麻酚酸A(THCA-A)在热及光照作用下发生脱羧反应生成[1].THC是天然大麻中精神活性最强的成分，其含量的多少是衡量大麻植物及其制品优劣的主要标准[2].CBD为非成瘾性成分，具有抗痉挛、抗焦虑、抗炎和抗氧化作用，为目前医学领域开发应用最多的一个大麻素活性成分.
截止2019年1月，共有41个国家宣布医用大麻合法，超过50个国家宣布了CBD合法，大麻植物中提取的CBD及其衍生物被广泛应用于医疗、保健品和化妆品等领域.THC的含量是区分工业大麻与娱乐性大麻的关键，欧盟等多国法律规定THC质量分数低于0.3%的称之为工业大麻，高于1%的属于娱乐性大麻/毒品，THC质量分数在0.3%到1%之间的为中间型大麻.云南省于2009年颁布了《云南省工业大麻种植加工许可规定》，规定THC质量分数低于0.3%(干物质)的大麻属原植物及其提取产品为工业大麻[3].从工业大麻花叶加工提取的THC质量分数高于0.3%的产品，适用毒品管制规定.然而，目前对大麻植物、保健品和化妆品中THC、CBD等大麻素及其衍生物的快速定量还没有建立技术标准，因此，建立大麻植物中8种主要大麻素(分子结构如图1所示)的快速定量检测方法具有非常重要的意义和社会应用价值.
目前对大麻素的检测方法主要有气相色谱−质谱法[4-5]、高效液相色谱法[6-7]、高效液相色谱−串联质谱法[8-10].由于大麻素类化合物的分子极性较大，气相色谱−质谱法在检测大麻素时需要衍生化处理，同时对热稳定性差的大麻素分析存在局限性，操作繁琐耗时[11].高效液相色谱法灵敏度低、受基质干扰较大[12]，不能满足痕量大麻素的检测.高效液相色谱−串联质谱(LC-MS/MS)法分析范围广、选择性好、灵敏度高、分析结果可靠[13]，是检测大麻素类化合物的优选方法.目前报道的大麻素类化合物的检测主要集中于THC、CBD和CBN，鲜见同时检测更多种大麻素的报道.因此本研究采用超高效液相色谱−串联质谱法同时对大麻植物中的8种主要大麻素进行定量分析，为建立大麻植物中多种大麻素检测标准和法医学鉴定提供技术支持.
1材料与方法
1.1仪器和试剂 岛津高效液相色谱仪LC20ADXR与三重四极杆LCMS-8040联用系统，配有LC-20ADXR×2输液泵，SIL-20AXR自动进样器，CBM-20A系统控制器，CTO-20A柱温箱，FCV20AH2高压流路切换阀，LCMS-8040三重四极杆质谱仪，LabSolutionsVer.5.91色谱工作站，CHIMADZUShim-packGIST-HPC18(φ2.1mm×100mm，3μm)和CHIMADZUShim-packVeloxPFPP(ϕ2.1mm×100mm，2.7μm)色谱柱.
8种大麻素标准品购自北京芬格尔安科技有限责任公司;乙腈(LC-MS级，德国Merck公司)，Mili-Q超纯水，乙酸铵(LC-MS级，美国Sigma公司)，甲酸(LC-MS级，美国Sigma公司).
大麻植物合法取自云南禄丰和泸西某大麻种植基地.
1.2分析条件
液相条件：CHIMADZUShim-packVeloxPFPP(φ2.1mm×100mm，2.7μm)色谱柱，柱温40℃;流动相A为20mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸缓冲液(pH值约为4)，流动相B为乙腈;洗脱程序：0～2min，50%B;2～5min，50%～95%B;5.01～8min，50%B;流速为0.3mL/min，进样体积为2μL.
质谱条件：电喷雾电离−正负离子模式(ESI±)，检测方式为多反应监测(MRM)，雾化气流量：3L/min，DL温度：250℃，加热块温度：400℃，干燥气流量：15L/min，转换打拿极电压：6.0kV，CID气：230kPa，8种大麻素检测的采集参数优化结果见表
1.1.3样品前处理
分别将来自不同产地的大麻植物样品的花和叶自然晾干后研磨成均匀细粉备用.准确称取10mg大麻植物粉末于20mL离心管中，加入10mL甲醇，超声震荡1h，然后在4℃条件下以12000r/min转速离心5min，取适量上层清液稀释，过0.22μm滤膜待测.
2结果
2.1LC-MS/MS检测条件优化 为选择合适的色谱柱，采用CHIMADZUShim-packGIST-HPC18(φ2.1mm×100mm，3μm)和CHIMADZUShimpackVeloxPFPP(φ2.1mm×100mm，2.7μm)2款色谱柱进行检测，结果表明五氟苯基色谱柱的分离效果较好，能有效将8种大麻素分离.此外，还对流动相组成、流动相梯度等参数进行了优化，获得了本文分析8种大麻素的LC-MS/MS检测条件(详见1.2).
在电喷雾电离−正负离子模式下，分别对8种大麻素100ng/mL单标溶液作一级质谱母离子全扫描，CBDA和THCA-A在负离子模式下的质谱响应值要高于正离子模式，因此这两种大麻素采用负离子模式进行检测，其余6种大麻素采用正离子模式进行检测.8种大麻素(混合标准溶液)的MRM色谱图见图2.
2.2灵敏度和线性 配制8种大麻素的系列质量浓度混合标准溶液(5、10、20、50、100、200、500μg/L)，在1.2分析检测条件下测定，分别以8种大麻素的定量离子峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标制作标准曲线，结果见表2.由表2中的数据可以看出，8种大麻素的标准曲线相关线性系数均大于0.99，表明8种目标分析物在质量浓度5～500μg/L内具有较好的线性关系，可满足定量分析的要求.以线性最低点混合标准溶液逐级稀释后测定，以信噪比(S/N)大于3作为检测限的检验水准，以(S/N)大于10作为最低定量限的检验水准，测得8种大麻素的LOD范围为0.13～1.26μg/L，LOQ范围为0.39～3.83μg/L(表2).
2.3精密度 分别测定8种大麻素的系列质量浓度混合标准溶液(5、50、500μg/L)的日内精密度(早上、中午和晚上)和日间精密度(连续3d，中午)，每个质量浓度重复采集5次.由其保留时间(tR)和定量离子对峰面积(A)的相对标准偏差(RSD)评估日内精密度和日间精密度，结果表明保留时间的RSD值为0.10%～0.43%，定量离子峰面积的RSD值为3.46%～13.41%(表3)，表明该方法的重现性好.
2.4稳定性 从−80℃取出8种大麻素储备液，配制成系列质量浓度混合标准溶液(5、50、500μg/L)样品，立即进样测定，然后在室温下放置24h，再次进样测定，根据标准曲线计算质量浓度，比较立即测定及室温放置24h后测定的各大麻素样品质量浓度，考察标准溶液室温放置24h的稳定性.
取新制备的同一大麻植物待测样品3份，一份立即测定，另外两份分别在室温及自动进样室放置24h后测定，以新鲜配制的溶液标准曲线计算质量浓度，考察待测样品在室温及自动进样室环境下放置24h的稳定性.结果显示,3组质量浓度大麻素标准溶液立即测定和室温放置24h后5次测定的质量浓度比值均接近于1，表明8种大麻素标准溶液在室温放置24h内稳定.样品在立即测定、室温及自动进样室放置24h后测定得到的8种大麻素质量浓度的RSD值在0.47%～1.85%之间，表明样品在室温及自动进样室环境下至少能稳定放置24h.
2.5耐受性取8种大麻素混合标准溶液(500ng/mL)样品及大麻植物待测样品，分别在柱温±5℃、流速±0.6mL/min、流动相pH值±0.2条件下进行试验，各大麻素的拖尾因子(Tailingfactor，TF)不超过2.0，各条件下标准溶液样品及待测样品重复进样6针，根据标准曲线计算质量浓度，8种大麻素质量浓度(ρ)的相对标准偏差不超过2.0%，以此考察本方法的耐受性.结果表明(表4)在柱温±5℃、流速±0.6mL/min、流动相pH值±0.2条件下，标准溶液样品及待测样品中8种大麻素的拖尾因子没有明显变化，标准溶液样品中各大麻素测定质量浓度的相对标准偏差在0.21%～1.56%之间，待测样品中各大麻素质量浓度的相对标准偏差为0.43%～1.87%，说明该方法的耐受性良好.
2.6大麻植物中8种大麻素的定量分析 根据所建方法对云南禄丰、泸西某大麻种植基地的大麻植物样品进行检测(图3)，由检测结果(见表5)可知，大麻植物样品中8种大麻素含量最高的为CBDA(3.99～11.06mg/g)，含量最低的为CBN(0.001～0.02mg/g).CBD的质量分数在1.27～7.47mg/g之间，THC的质量分数在0.13～1.79mg/g之间，THC干物质质量分数低于0.3%，符合《云南省工业大麻种植加工许可规定》的标准.
3讨论
目前，国内外基于高效液相色谱−串联质谱法对大麻素的检测研究主要集中在大麻食品基质[9-10,14-16]及人体毛发[8,17]，关于大麻植物中大麻素的检测方法报道较少[18]，且国内外对大麻素的检测种类大多仅涉及THC、CBD、CBN.本研究建立了大麻植物中8种大麻素类化合物的快速检测方法，扩充了大麻植物中大麻素的检测种类.本研究采用溶剂直接提取法，用甲醇提取大麻植物中8种大麻素，每个样品仪器分析仅需8min(图3)，具有较高的分析效率，适用于大批量样品的定量分析.
由于大麻素含有酚羟基或羧基，极性较大，普通的C18色谱柱很难对其保留.五氟苯基反向色谱柱(PFPP)以超纯硅胶为基质，表面键合有五氟苯基，五氟苯基可产生较强的偶极诱导作用，对芳环、杂环化合物等易极化的物质有较强的分离能力，PFPP柱特别适用于苯基化学结构相似的大麻素类物质的分离.
通过对方法的线性范围、LOQ、LOD、精密度等关键参数的评估，表明8种大麻素的测定在质量浓度5～500μg/L内具有较好的线性关系，8种大麻素的LOD范围为0.13～1.26μg/L，LOQ范围为0.39～3.83μg/L，方法的灵敏度高，定量准确，可满足痕量大麻素的定量分析要求.保留时间的RSD值为0.10%～0.43%，定量离子峰面积的RSD值为3.46%～13.41%，表明本方法的保留时间、定量离子峰面积的重现性好，同时该方法具有良好的稳定性及耐受性.将本方法应用于大麻植物检测，在6份大麻植物样品中均检测出8种大麻素，其中THC的质量分数低于0.3%，表明种植大麻产品符合《云南省工业大麻种植加工许可规定》的标准.——论文作者：任雁明，解润芳，王蕊，熊积斌，赵臣飞，杨盛晔，杨永祎，李树华**，张瑞林**
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