摘要: 为确定 7 种景天科多肉植物白粉病的病原菌，本研究通过显微形态观察、致病性测定和分子生物学的方法对其进行鉴定，并构建系统发育树。结果表明: 该病原菌闭囊壳暗褐色至黑色，球形或扁球形，壁细胞呈不规则多边形; 附属丝 5 ～ 18 根，丝状不分枝，上下近等粗或顶端略细，褐色或基部褐色，向上渐无色; 子囊 3 ～ 5 个，卵形或长卵形，无色，有短柄或无柄; 子囊孢子 3 ～ 5 个，长卵形或椭圆形; 分生孢子梗直立或稍弯曲，分生孢子单生，长筒柱形、长椭圆形; 病原菌接种叶片症状与自然发病状态叶片一致。病原菌 rDNA - ITS 序列的系统发育树显示，该菌与八宝属( Hylotelephium sp. ) 、景天属( Sedum sp. ) 和伽蓝菜属( Kalanchoe sp. ) 叶片白粉病的病原菌景天白粉菌( Erysiphe sedi) 聚在一支上。据此确定景天科多肉植物白粉病的病原为景天白粉菌( Erysiphe sedi) 。
关键词: 多肉植物; 白粉病; 病原鉴定; 景天白粉菌
景天科多肉植物又称多肉花卉或多水植物，其营养器官( 根、茎、叶) 肥大多汁，可储备大量水分和养分，耐旱、耐高温能力强[1 - 2]，外形小巧可爱，色彩斑斓，广受年轻人喜爱。景天科多肉植物已报道的病害有黑腐病[3 - 4]、细菌性褐腐病[5]、白粉病[6]等，白粉病的发生较为常见。白粉菌是一类分布广泛，对温度和湿度适应范围广，专性寄生于林木、花卉、蔬菜等植物表面，能产生白色至灰白色粉层的病原真菌，主要侵染植物的地上部分。一般情况下，下部叶片较上部叶片易侵染，发病后期，整个叶片布满白色粉层且散生黑色小点。病菌以菌丝体或闭囊壳在病叶上越冬。目前，国内外已报道的白粉菌有 872 种、 47 个变种，其中包含 16 个有性属和 11 个无性属[7 - 8]。白粉菌的寄主包括 44 目 169 科 1 617 属 9 838 种被子植物，其中 9 176 种为双子叶植物，662 种为单子叶植物[9 - 11]。
目前对景天科多肉植物的研究多集中于繁殖栽培、引种栽培和景观应用等方面[12 - 13]，国内关于景天科多肉植物病害病原菌鉴定的报道较少。已报道的有多肉植物彩虹黑腐病病原菌为尖孢镰刀菌 ( Fusarium oxysporum) [3]; 多肉植物翡翠景天黑腐病病原菌为山扁豆生棒孢( Corynespora cassiicola) [4]; 进境多肉植物细菌性褐腐病病原菌为菠萝泛菌( Pantoea ananatis) [5]; 内蒙古景天科植物白八宝( Hylotelephium pallescens) 和费菜( Phedimus aizoon) 白粉病病原菌均为景天白粉菌( Erysiphe sedi) [6]。引起景天科多肉植物白粉病的病原菌有 E. sedi、E. umbilici、Golovinomyces orontii、Podosphaera xanthii、Oidium sub. Pseudoidium 等，其中景天白粉菌的寄主有很多种，包括景天科的八宝属( Hylotelephium sp. ) 、景天属 ( Sedun sp. ) 、伽蓝菜属( Kalanchoe sp. ) [14 - 15]、落地生根属( Bryophyllum sp. ) [16]和瓦松属( Orostachys sp. ) [17]等植物。现阶段关于高海拔地区景天科多肉植物病害特性及病原种类的研究尚缺。鉴于此，本研究采集青海西宁景天科不同种类多肉植物白粉病病株，结合形态学和分子生物学，鉴定 7 种景天科多肉植物白粉病的病原，为景天科多肉植物白粉病发生规律和综合防治的研究提供参考依据。
1 材料与方法
1. 1 样品的采集与处理
2018—2019 年，在青海省西宁市人民公园和青海大学附近花卉市场采集 7 种发病的景天科多肉植物叶片( 图 1) 。采集过程中，将具有白粉病症状且粉层较薄的叶片，剪成约 0. 5 cm × 0. 5 cm 的方块，放入 4% 戊二醛固定液中保存，以备扫描电镜观察。
1. 2 病原菌致病性测定
依据柯赫氏法则，采用孢子悬浮液喷雾法对健康植株进行回接。收集植株病叶表面的孢子，配成浓度为 1 × 106 个/mL 的孢子悬浮液，均匀喷洒于健康叶片正反面，并以喷洒无菌水作对照，( 25 ± 2) ℃ 下培养。每天喷施无菌水进行保湿，5 d 后观察植株叶片的症状，收集病原菌进行显微形态学的鉴定[18]。
1. 3 病原菌的形态学鉴定
用解剖针挑取成熟的闭囊壳或无性繁殖体( 分生孢子) 制作临时玻片，在光学显微镜下观察闭囊壳、子囊、子囊孢子的形态特征并进行描述及拍照; 利用扫描电镜对无性型白粉菌的分生孢子、分生孢子梗的形状等超微结构进行观察及拍照[19]。根据观察和测定的结果，参照白粉病菌鉴定特征[13，20 - 21]，确定景天科多肉植物白粉病的病原菌。
1. 4 病原菌分子生物学鉴定
1. 4. 1 白粉菌 DNA 的提取
DNA 提取的方法主要是按照 Hirata and Takamatsu 方法[22]略做改进: 滴灭菌水于载玻片，在体视镜下用解剖针挑取零散且无叶片组织的 30 个或以上的闭囊壳，盖上盖玻片并轻轻按压研磨，至闭囊壳全部破碎; 吸取 50 μL 5% Chelex - 100，与已磨碎的闭囊壳混匀并转移混合液于 1. 5 mL 的离心管，离心 1 min( 12 000r/min) ; 置于 56 ℃水浴锅中水浴 20 min，离心 1 min( 12 000r/min) ; 置于 92 ～ 97 ℃水浴锅中水浴 8 min，离心 1 min( 12 000r/min) ; 置于 4 ℃或 - 20 ℃冰箱以备用。
1. 4. 2 PCR 扩增
利用引物 ITS5( 5' - GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG - 3') /P3( 5' - GCCGCTTCACTCGCCGTTAC - 3') 对病原菌 rDNA - ITS 基因序列进行 PCR 扩增[23]。反应体系 25 μL: 模板 DNA 1 μL，引物各 1 μL， 2 × Bios Taq PCR Master Mix 12. 5 μL，ddH2O 7. 5 μL。反应程序为 95 ℃预变性 4 min; 94 ℃变性1 min， 54 ～ 60 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min，35 个循环; 72 ℃再延伸 8 min; 4 ℃保存。
1. 4. 3 系统发育树的构建及序列分析
PCR 扩增产物经 1. 5% 琼脂糖凝胶电泳检测后，送至生工生物工程( 上海) 股份有限公司进行纯化测序。测序结果在 NCBI 的 GenBank 数据库中进行 BLAST 序列同源性分析; 利用 MEGA 5. 2 软件以邻接法( N - J) 构建系统发育树，并分析其亲缘关系，确定病原菌的分类地位。
2 结果与分析
2. 1 病害症状
景天科多肉植物白粉病病原菌主要侵染植物叶片的正反面( 图 1) ，发病初期叶片出现白色近圆形或不规则的小粉斑，后蔓延形成白色片状或边缘不整齐的块状斑，严重时整个叶片覆盖灰白色粉层( 菌丝体、分生孢子和分生孢子梗) ，其上散生若干褐色至黑色的小点，为闭囊壳( 图 1a) ，后期发病叶片出现褪绿、黄化和皱缩的现象，有些叶片背面较叶片正面发病明显，发病严重时可导致整株植物死亡 ( 图 1h) 。
2. 2 病原菌的致病性测定
接种 5 d 后，处理植物开始发病，出现白色粉状物。接种 15 d 左右，大部分叶片具有白色粉斑，对照组植株无明显变化。依照柯赫氏法则，用解剖针挑取病斑上的粉层用光学显微镜观察，观察到菌丝体的特征均与所采集的发病叶片上观察到的结果一致。说明挑取的病原物为景天科多肉植物白粉病的病原菌。
2. 3 病原菌形态学特征选
取凹叶景天白粉病病原菌进行镜检观察其形态学特征。如图 2a 所示，闭囊壳聚生或散生，易生长于菌丝层内，暗褐色至黑色，近球形或扁球形，直径 95 ～ 115 μm，壁细胞呈不规则多边形; 附属丝 5 ～ 18 根，丝状，直或稍弯曲，不分枝，长 35 ～ 195 μm，为闭囊壳直径的 0. 3 ～ 2. 3 倍，上下等粗或顶端略细，具有 0 ～ 5 隔膜，全长褐色或基部褐色，向上渐无色; 子囊 3 ～ 5 个，卵形或长卵形，无色，有短柄或无柄， 50 ～ 75 μm × 35 ～ 52. 5 μm; 如图 2b 所示，子囊孢子 3 ～ 5 个，长卵形或椭圆形，11. 5 ～ 19. 5 μm × 8. 4 ～ 14. 5 μm; 分生孢子梗直立或稍弯曲( 图 2c) ，分生孢子单生，长筒柱形或长椭圆形。
2. 4 病原菌分子生物学鉴定
将测序结果在 NCBI 的 GenBank 数据库中用 BLAST 进行同源性比对，并将序列上传至 GenBank 数据库，获 得 ITS 序 列 登 录 号 为 MT659927、MT659928、MT659929、MT659930、MT659931、MT659932、 MT659933。利用 MEGA5. 2 构建病原菌 rDNA-ITS 基因序列系统发育树( 图 3) ，结果显示 7 种景天科多肉植物的病原菌与八宝属( Hylotelephium sp. ) ( JX173289) 、景天属( Sedum sp. ) ( JX173290) 和伽蓝菜属 ( Kalanchoe sp. ) ( MT568632) 白粉病的病原菌聚在同一个分支上，亲缘关系最为接近，但与同属的其他白粉菌亲缘关系相对较远。并结合形态学特征进一步证实了景天白粉菌( E. sedi) 为 7 种景天科多肉植物白粉病的病原菌。
3 讨论与结论
本试验对 7 种景天科多肉植物白粉病病原菌进行形态学观察、致病性测定，得到的形态学特征与已报道的景天白粉菌( E. sedi) 一致，且对病原菌 rDNA-ITS 基因序列分析也表明二者具有极高的同源性。由此确定引起景天科多肉植物白粉病的病原为景天白粉菌( E. sedi) ，属子囊菌门( Ascomycetes) 白粉菌目( Erysiphales) 白粉菌科( Erysiphaceae) 。刘铁志[6]报道引起内蒙古景天科植物白八宝( H. pallescens) 和费菜( S. aizoon) 白粉病的病原菌及方治豪等[24]报道引起新疆长药八宝白粉病的病原菌均为景天白粉菌( E. sedi) 。由此可知，景天白粉菌是景天科多肉植物致病的重要病原菌之一。
本研究进行了景天科多肉植物白粉病病原菌的鉴定，明确了青海地区 7 种景天科多肉植物白粉病的病原，研究结果可为日后该地区景天白粉病的有效防治提供科学依据，为有效控制病害的扩展和蔓延奠定基础。——论文作者：
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