摘 要：传统热杀菌会对食品品质产生不利影响，造成食品颜色变化、产生异味、营养损失等不良后果;非热杀菌技术是食品工业新型加工技术，处理过程中可以保持相对较低的温度，对食品的色、香、味以及营养成分影响较小;同时有利于保持食品中各种功能成分的生理活性，可以满足消费者对高品质食品的要求。芽孢在加工过程中抗性强，在食品中萌发和生长的潜力较大，因此，利用低热或非热灭菌技术对芽孢进行灭活是当前食品工业面临的严峻挑战和重要课题。本文综述现有非热杀菌技术(如高静压技术、高压CO2技术、低温等离子体技术、紫外辐射技术、高压脉冲电场技术等)独立处理或与其他处理技术相结合对芽孢灭活的效果及其机理，着重讨论其在食品行业中的应用以及芽孢灭活的分子机制，以期为生产安全食品、减少不同种类食品中微生物污染提供解决方案。
关键词：非热杀菌技术;芽孢;高静压技术;高压CO2技术;低温等离子体技术
作为人类赖以生存和发展的重要物质前提，食品的质量安全直接影响国民身体健康及生命安全。微生物导致的腐败变质是威胁食品质量安全、造成食品工业中巨大经济损失的主要因素之一，因此，杀菌成为食品加工过程中的必要工序。食品工业中应用的杀菌方法主要包括热杀菌和非热杀菌，其中热杀菌(如巴氏杀菌、高温瞬时杀菌等)因灭菌效果好、操作方便等优点而得到广泛应用。然而，由于高温可能会对食品品质产生影响，导致食品颜色变化、产生异味、营养损失等不良后果，同时高温杀菌具有污染环境、能源消耗量大等劣势，因此非热杀菌技术日益成为新型杀菌技术研究和开发的重点[1]。
非热杀菌技术是食品工业新型加工技术，具有杀菌条件易控、受外界条件影响较小等优点;非热杀菌处理过程中，食品物料可以保持相对较低的温度，对食品的色、香、味以及营养成分影响较小，同时有利于保持食品中各种功能成分的生理活性，可以满足消费者对高品质食品的要求[1]。目前食品工业中灭活芽孢的非热杀菌技术主要有如高静压(high hydrostatic pressure，HHP)技术、高压CO2(high-pressure CO2，HPCD)技术、低温等离子体(non-thermal plasma，NTP)技术、紫外辐射(ultraviolet light，UV)技术、脉冲电场(pulsed electric field，PEF)技术等，本文综述这些非热杀菌技术独立处理或与其他处理技术相结合对芽孢灭活的效果及其机理，分析各种非热杀菌技术的研究进展和应用前景，着重讨论其在食品行业中的应用以及芽孢灭活的分子机制，以期为生产安全食品、降低不同种类食品中微生物污染提供解决方案。
1 芽孢与食品安全
芽孢是由产芽孢杆菌在营养条件缺乏时产生的休眠体，广泛存在于环境中，是食品工业中的主要微生物污染源之一，易引起食品安全事故。19世纪后半叶，芽孢作为细菌休眠体被研究者发现，并因其高抗性逐渐受到重视，已有大量研究致力于探究芽孢抵抗外界极端环境的分子机制。尽管芽孢在休眠状态下代谢并不明显，但其仍能持续监测周围环境的营养状况，并在适宜的环境条件下萌发和恢复生长[2]。此外，芽孢对湿热和干热、紫外线辐射和γ射线辐射、极端干燥(包括真空)和氧化剂等不利条件均具有高抗性，因此在加工处理中芽孢极有可能存在于最终产品中，并在一定条件下萌发生长，最终导致食品腐败，甚至引起食源性疾病[3]，芽孢的灭活效果可用来评价食品的杀菌程度[4]。
温度低于100 ℃的热杀菌处理可以杀灭致病菌以及其他有害微生物，但不足以杀灭抗逆性极强的细菌芽孢[5]。芽孢的高度抗逆性主要是由于其独特的多层结构(孢外壁、芽孢衣、外膜、皮层、内膜、芽孢核等)所致[6]，这些结构可以起到保持芽孢内部水分含量、限制有害物质进入等作用，常规的食品工业杀菌工艺很难将其危害性消除。对芽孢进行灭活的应用和分子机制研究一直以来都是食品工业所面临的严峻挑战和重要课题。
2 HHP技术
2.1 HHP杀菌技术研究与应用现状
HHP技术是目前食品商业杀菌中应用最广泛的新型非热杀菌技术[7]，主要是在冷藏或室温(4～25 ℃)下，利用高压(400～600 MPa)对食品进行处理以延长其货架期，保持食品新鲜，其杀菌效果与巴氏杀菌相当，与传统热杀菌相比可以较好地保持食品的品质[8]。近年来HHP技术在食品杀菌中的应用逐渐成熟，国内外关于 HHP灭活芽孢的研究报道逐渐增多(表1)，无论是在纯培养条件还是在食品介质中，HHP技术都具有优良的芽孢灭活效果。
目前，HHP技术在灭活芽孢中的应用仍处于基础研究阶段，少见对商品化的产品进行芽孢杀灭， HHP灭活芽孢受到pH值、温度等多种外部因素的影响：在低pH值条件下进行HHP处理时，芽孢的热抗性更 低 [14]; HHP 处理温度影响芽孢的萌发状况， Black等[15]发现，诱导芽孢释放吡啶二羧酸(dipicolinic acid，DPA)并萌发的最佳温度随压力的变化而发生改变;Robertson等[16]研究了两种加压流体的HHP处理对芽孢杆菌属芽孢的灭活效果，结果表明使用硅油作为加压流体的HHP处理具有更好的灭活效果。由此可见，HHP 技术在实际应用中需要根据产品的实际情况确定生产参数以优化芽孢灭活效果。
此外，对HHP灭活芽孢动力学的研究也取得了一定进展。Olivier等[17]首次将F值(在一定杀菌压力和温度下，杀死一定浓度的某种微生物所需时间)用于全面定量地确定HHP灭活芽孢的效果;Uchida等[18]利用Weibull 模型对600 MPa处理条件下不同糖度的麦芽提取物肉汤中 A. acidoterrestris芽孢灭活过程进行拟合，并确定一级动力学参数;Doona等[19]通过HHP设计了芽孢萌发动力学的 “准化学”模型，将萌发和灭活的微分方程模型整合到一个由HHP建立的芽孢动力学综合模型中。
2.2 HHP灭活芽孢机制
HHP灭活芽孢的机制可以归结为3 个阶段，其中包括高压诱导芽孢萌发阶段、芽孢多层结构的破坏阶段以及芽孢的最终灭活阶段[9]。HHP处理过程中高压及其变化直接导致芽孢内部结构的变化，使其产生一定的机械损伤，同时改变芽孢膜蛋白的理化性质以及芽孢内部的水分含量，引起其内部DPA释放、酸溶性小蛋白(small acid-soluble proteins，SASPs)降解、萌发受体(germinant receptors， GRs)激活等一系列生理变化，进而引起芽孢亚致死损伤、萌发和失活[20]。
近年来，对HHP诱导芽孢萌发的研究取得了很大进展，尤其是HHP诱导芽孢萌发的分子机制[6]，随着HHP 处理压力的变化，诱导芽孢萌发的机制也会发生变化。低压(100～150 MPa)可以诱导芽孢萌发。Black等[21] 的研究表明，150 MPa、37 ℃处理7 min可使约90%芽孢萌发，这种萌发是通过诱导GRs实现的。一旦GRs被低压处理激活，芽孢内核释放Ca-DPA从而激活芽孢内主要的皮质溶解酶(cortex lytic enzymes，CLEs)。低压条件下，由于萌发蛋白酶的激活，芽孢中的SASPs会发生降解，从而导致芽孢比更高压力(500 MPa)单独处理下更易灭活，这也说明SASP在芽孢热抗性中的重要作用[22]。中高压(500～600 MPa)也可以诱导芽孢萌发，其机制与低压诱导芽孢萌发不同[23]。中高压主要通过作用于芽孢内膜上的DPA通道诱导DPA以及其他小分子物质释放，从而激活芽孢内的CLEs。这种机制在枯草芽孢杆菌(B. subtilis)芽孢和蜡样芽孢杆菌(B. cereus)芽孢中都得到了证明，表明中高压处理可以诱导部分具有皮层水解机制芽孢的萌发[24]。此外，孙静等[25]的研究表明，无论低压还是中高压HHP处理都可以促进芽孢核中 Ca-DPA的释放和皮层的降解，从而降低芽孢的热抗性，而在350 MPa和550 MPa的中高压处理下，B. subtilis芽孢热抗性降低的原因是高压诱导芽孢产生的亚致死损伤，而不是芽孢萌发。
因此，HHP可以调节芽孢的萌发机制，降低其对后续灭活处理的抗性。然而，高压诱导的芽孢萌发只发生于芽孢杆菌属，对于梭菌属则没有这种效应[24]。由于部分芽孢对目前工业上应用的HHP处理(例如650 MPa、 50 ℃)具有抗性以及芽孢自身独特的生理特性，因此可以改进HHP工艺或配合其他杀菌条件来灭活芽孢，如间歇HHP工艺可以先诱导芽孢萌发，泻压后施加更高的压力灭活芽孢;HHP与热处理、超声波、PEF、UV、辐照、细菌素、化学试剂等灭菌技术相结合可以降低HHP 所需压力、缩短处理时间并降低处理成本。这种基于现代栅栏技术、以HHP为主的复合杀菌方法将成为非热杀菌领域最具潜力和经济效益的一项技术[20]。
3 HPCD技术
3.1 HPCD杀菌技术研究与应用现状
HPCD是一种通过CO2的分子效应及其他未知机理而起到灭活微生物作用的一种新型杀菌技术，一般来说，HPCD主要利用50 MPa以下处于特殊形态的CO2，包括超临界态和亚临界态CO2，其中应用较多的是超临界CO2 [26]。自1951年Fraser等[27]首次将HPCD作为杀菌技术灭活大肠杆菌菌体细胞，在过去的60多年中，HPCD 的杀菌效能及其机理逐渐成为非热杀菌领域的研究重点。与传统杀菌方式相比，HPCD杀菌技术具有一定优势：CO2不易燃且无毒，这意味着HPCD处理是环境友好的，且无有毒物质残留;用于灭菌的CO2压力(通常低于30 MPa)远低于HHP(100～600 MPa)处理，这使得HPCD技术中使用的压力更易于控制;此外，与热处理相比，HPCD处理时温度更低，因此对食品的营养成分和理化性质的影响较小[5]。李凤娟[28]采用响应面分析实验对HPCD灭活B. subtilis芽孢效能进行了研究，在压力25.6～28.8 MPa、温度40～47 ℃、保压时间 36.5～47.0 min的条件下，芽孢失活率可达到3.48 个数量级，这表明HPCD对芽孢具有良好的杀灭效果，其中压力、温度、保压时间都是重要的影响因素。
虽然HPCD可以有效杀灭致病菌、腐败菌、酵母以及霉菌的营养细胞(低于30 MPa、20～40 ℃)， HPCD在较温和的温度(20～40 ℃)下难以使结构更加复杂的细菌芽孢失活[5]。因此，为了增强HPCD技术对芽孢的灭活效果，大量研究将HPCD与热处理、循环加压、化合物处理等技术结合，利用HPCD复合杀菌技术提高灭活细菌芽孢的效能。高媛等[29]的研究表明45 ℃ 预热处理可以提高HPCD(20 MPa)芽孢失活率1.4 个数量级;Karajanagi等[30]提高HPCD处理(7～9 MPa) B. subtilis芽孢的温度(60～70 ℃)，杀灭芽孢数量可达 7(lg(CFU/mL));Spilimbergo等[31]使用循环加压的方法处理B. subtilis芽孢，在较低温度(36～50 ℃)，杀灭芽孢数量可达0.8～2.0(l g(CFU/m L)); Spilimbergo等[32]将HPCD与PEF技术相结合(20 MPa、 40 ℃、900 min)处理B. cereus芽孢，杀灭芽孢数量约为 1.5(lg(CFU/mL))。此外，有研究表明，HPCD处理与乙醇、乙酸、柠檬酸、H2O2、PAA等化合物协同处理也可提高芽孢的灭活效果[5]。
3.2 HPCD灭活芽孢机制
目前对于HPCD灭活芽孢的机理主要有两种主流的假设：一部分学者通过HPCD灭活芽孢的动力学研究，提出 “萌发灭活机制”，即芽孢在HPCD处理过程中首先被活化和萌发，然后被灭活[33];此外，有学者通过HPCD处理后芽孢失活的形态学和分子学分析，提出了“结构破坏和失活机制”，这是另一种可能的HPCD处理芽孢使其失活的假设机制，即芽孢结构被破坏，导致芽孢死亡[34]。Rao Lei等[35] 对B. subtilis芽孢进行HPCD处理，对芽孢的萌发、内膜和皮层的渗透性、DPA的释放情况以及芽孢形态和内部结构的变化进行了研究，结果表明HPCD处理不会使芽孢萌发也不会降低其热抗性，但会增加芽孢内膜和皮层的渗透性，破坏芽孢的结构。此外，根据B. subtilis芽孢在 HPCD处理下的灭活动力学，可以将灭活过程分为两个阶段：第一阶段灭活率较低，而第二阶段芽孢显著失活。第一阶段中，CO2渗透进入芽孢外部结构中，可能导致一部分重要化学物质的释放从而促进芽孢在结构不被破坏的状态下失活[36];也有研究提出HPCD灭活芽孢与一些酶的失活有关，由于CO2的水合产物导致芽孢内部pH值的降低从而抑制芽孢内部的正常代谢[37]。这些机制可能在处理过程中同时发生，并最终导致芽孢的失活。
虽然已有研究提出了几种HPCD处理灭活芽孢的机制，但由于缺乏丰富和明确的数据，HPCD灭活芽孢的机理很难得到完全阐明，需要进行更深入和更全面的分析来探明HPCD处理灭活细菌芽孢的机理[38]。虽然近期的研究表明“结构破坏和失活机制”更具说服力，但目前 HPCD是如何准确地作用于芽孢并破坏孢子的内膜的机制仍不清楚，需要进一步的实验来研究内膜特性的变化，并鉴定其损伤导致HPCD处理芽孢失活的特定蛋白质。此外，还需要加强HPCD灭菌的数学模型的建立，以阐明灭菌机理并确定最佳工艺条件[5]。
4 NTP技术
4.1 NTP杀菌技术研究与应用现状
等离子体被称为除固态、液态、气态以外的第4种物质存在状态，广泛存在于宇宙之中，由完全或部分离子化、整体呈现电中性的多种活性粒子(原子、电子、放电粒子、UV光子等)组成。当对气体施加的能量超过其本身分子间作用力时，气体分子会被激发产生自由电子，这些自由电子会与周围的分子或者原子发生碰撞，从而产生能量更高的激发态原子、离子以及自由电子[39]，各种粒子的混合体即为等离子体。在NTP中，电子的温度远低于其他粒子的温度，从而保持一种热力学不平衡状态，因此NTP的整体温度可以保持在相对较低的温度(低于60 ℃)[40]。与传统热杀菌技术相比，NTP技术处理温度较低、杀菌速度快，具有一定的优势，同时应用于食品杀菌时，具有无有害成分残留的优点[41]。
NTP技术可以有效杀灭食品介质中的芽孢，不同类型等离子体激发装置对芽孢均可以产生灭活效果，Kim 等[42]使用微波NTP处理洋葱粉中的B. cereus芽孢，其杀灭芽孢数量可达1.1～2.1(lg(CFU/mL));Los等[43]用空气介质阻挡放电(dielectric barrier discharge，DBD)等离子体处理谷粒中的萎缩芽孢杆菌(B. atrophaeus)芽孢，其杀灭芽孢数量约为5(lg(CFU/mL));Hertwig等[44]使用射频等离子体射流处理黑胡椒中的B. subtilis和B. atrophaeus芽孢，其杀灭芽孢数量为2.4～2.8(lg(CFU/mL))。
NTP对芽孢灭活效果受很多因素的影响，如工作气体组成、输入功率、处理时间等处理参数，这些参数会改变等离子体的电子密度、带电粒子和自由基的浓度以及UV光子的数量等理化性质;此外，基质组成和尺寸、水分活度、有机物等外部环境条件以及芽孢自身的性质也是影响等离子体对芽孢灭活效果的重要因素[45]。 NTP灭活芽孢的影响因素总结如表2所示。
4.2 NTP灭活芽孢机制
迄今为止，NTP灭活芽孢细胞的确切机制仍不清楚，等离子体诱导的芽孢损伤是否会致其萌发尚无定论。近年来，研究集中于从等离子体对芽孢的外部结构以及内部成分等不同靶点来探究NTP灭活芽孢的机理。
Raguse等[52]研究表明，等离子体作用于B. subtilis 芽孢外膜、内膜、芽孢衣等结构进而导致芽孢灭活，通过原子力显微镜可以观察到经过等离子体处理后的芽孢表面粗糙度增加并产生裂纹，这可能是由于活性氧(reactive oxygen species，ROS)和活性氮(reactive nitrogen species，RNS)等自由基的作用以及离子轰击与积累对这些芽孢结构中的化学键产生破坏[53]。而对于等离子体产生的UV光子，其主要作用靶点是位于芽孢核内的DNA，DNA受UV辐射会产生对芽孢具有潜在致命危害的光产物胸腺嘧啶聚合物[54]。Roth等[55]发现，缺乏核苷酸切除修复和α/β型DNA结合SASPs的B. subtilis芽孢对 NTP具有更高的敏感性，而缺乏芽孢光产物裂解酶DNA 修复途径芽孢的敏感性较低，因此可见，NTP是通过芽孢光产物形成以外的机制导致DNA损伤。此外，NTP对芽孢中的关键代谢蛋白(Ger A、Ger B和Ger K)、离子和DPA通道(SpoV)、其他萌发相关酶(如CLEs、 CwlJ、SleB)[54,56]产生影响进而导致芽孢失活。因此，等离子体灭活芽孢可分为两个阶段：在第一阶段，NTP 的UV光子、自由基或离子迅速灭活位于顶部的大多数芽孢;随着等离子体粒子渗透得更深，到达灭活的第二阶段，即芽孢外部结构、DNA和蛋白质逐渐受到活性物质(如RNS、ROS和离子)的蚀刻作用，导致芽孢灭活[45]。
NTP对细菌芽孢具有优越的灭活效果，在食品杀菌中具有广阔前景，然而其诱导芽孢灭活的机制尚没有得到完全阐述，NTP的杀菌效果与等离子体种类、参数设置以及环境因素等密切相关，这也增加了实际应用和优化加工条件的难度[57]。
5 UV技术
5.1 UV杀菌技术研究与应用现状
紫外光的波长位于100～400 nm范围内，包括UV-A (315～400 nm)、UV-B(280～315 nm)、UV-C (200～280 nm)、VUV(100～200 nm)。其中在食品工业中主要利用波长在200～280 nm范围内的UV-C进行杀菌，UV辐射广泛用于液体介质食品的杀菌以及延长固体食品如新鲜产品、肉制品和蛋制品的货架期[58]。一般称UV及其邻近可见光谱范围与其他能量较低的辐射为非电离辐射，而X射线、γ射线以及电离粒子(β射线、α射线、质子)等则为电离辐射，非电离辐射的吸收可以导致原子和分子产生激发电子[59]。 UV辐射对菌体细胞的杀菌机理主要是其可以产生大量能量使营养细胞DNA中的嘧啶碱基形成二聚体，从而干扰DNA转录和翻译过程[60]。然而，芽孢比营养细胞的 UV抗性更强，有研究表明杀灭90%炭疽杆菌芽孢所需的 UV强度为810 J/m2 ，而杀灭90%同一菌株营养细胞所需的UV强度为60 J/m2[61];可见芽孢对UV辐射具有抗性，该抗性是由于部分芽孢可以在UV辐射损伤后进行修复[62]，这种修复可能是由于光解酶可以与UV形成的二聚体结合，并利用从可见光中获得的能量来逆转二聚体的形成[63]。为了克服芽孢对UV的抗性和光解酶修复的现象，有研究利用准分子UV激光照射来增强芽孢灭活效率[64]。此外，将 UV处理与热、H2O2等处理结合可以提高UV辐射对芽孢灭活的效果[65]。
UV辐射作为非热杀菌技术，在液体食品的杀菌和固体食品货架期的延长等方面具有重要应用。然而，由于芽孢对UV辐射具有较强抗性以及光修复能力，选择合适的UV辐射剂量和协同处理方法是应用中需要重点关注的问题。此外，由于UV可通过各种有机光反应在食品中产生自由基从而对食品品质产生不良影响，如蛋白质变性、脂质氧化、颜色变化、异味、营养物质损失等[59]，在UV辐射应用中应选择适宜的食品进行处理以减少其品质的降低。
5.2 UV灭活芽孢机制
UV主要通过对芽孢的外部结构进行破坏进而灭活芽孢。Esbelin[66]研究了芽孢衣缺陷菌株、α、β型SASPs 缺陷菌株与野生菌株的芽孢在320～1 770 mJ/cm2 脉冲 UV和25～150 mJ/cm2 连续UV-C处理下的灭活情况，结果表明芽孢衣缺陷型菌株对脉冲UV的敏感性显著高于野生型菌株，α和β型SASPs缺陷菌株芽孢对两种处理的敏感性均高于野生型菌株，表明芽孢的外部结构在保护芽孢抵抗UV中具有重要作用，而α、β型SASPs是芽孢进行光修复的重要成分。此外，Warriner等[67]研究发现UV(27.10 J/mL)和温和热处理(60 ℃、3.58 min)协同作用可以将杀灭B. coagulan芽孢的数量提高 2(lg(CFU/mL))，这表明UV处理可能导致芽孢的热敏性增强从而提高芽孢灭活效果。
6 PEF技术
6.1 PEF杀菌技术研究与应用现状
PEF技术主要利用短周期脉冲电流灭活食品中的微生物[68]，PEF杀菌常用电路强度一般为15～100 kV/cm、脉冲1～100 kHz、放电频率1～20Hz[1]。现有研究结果表明，PEF具有许多优于巴氏杀菌的特点，但是PEF的应用仍然仅限于液体产品中[69]，其对于半固体或固体产品灭菌的适用性尚未确定。PEF对食品品质的影响较小，可以在保持食品营养价值的同时灭活微生物营养细胞，但其灭活细菌芽孢的应用相对较少[70]。为了有效灭活细菌芽孢，有研究将PEF与热处理或抗菌化学提取物结合。据报道，PEF在195 kJ/kg下与133 ℃热处理结合，B. subtilis 芽孢杀灭芽孢数量可达4(lg(CFU/mL))，模型分析结果表明热处理和PEF处理的杀灭芽孢数量分别为 1.15(lg(CFU/mL))和3.2(lg(CFU/mL))[70]。此外，有研究表明抗菌化学提取物(如精油和多酚)与PEF 协同作用对于芽孢杆菌属芽孢有较好的灭活效果，如各种精油具有的活性成分可以作为萌发物与受体结合的屏障，抑制芽孢萌发，对B. subtilis芽孢抑制活性最高的是豆蔻精油，其杀灭芽孢数量约为3.12(lg(CFU/mL))[71]。
6.2 PEF灭活芽孢机制
国内外学者对PEF的研究相对比较成熟，对其杀菌机理提出了电崩解理论、电穿孔理论、臭氧效应、黏弹极性形成模型等假说，其中电崩解理论和电穿孔理论更为广大学者所接受[69]。电崩解理论是指外加电场强度可以增大细胞膜上的跨膜电位差，并且电位差随着电场的增强不断增大，细胞膜厚度减小，当电位差达到临界崩解电位差时细胞膜就会发生破裂穿孔[72];而电穿孔理论是指PEF作用于微生物细胞膜会改变其脂肪和蛋白质分子的结构，使微生物细胞膜收缩形成小孔，随着电场强度的增强，细胞膜形成大量小孔，细胞膜通透性增大，胞内物质泄漏进而导致微生物失活[73]。
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PEF灭活芽孢的机理主要与芽孢多层结构在PEF处理下发生的变形有关(表3)。Barsotti等[74]研究表明，在电场强度为15 kV/cm、脉冲时间为5 s的脉冲作用下，盐溶液中的B. atrophaeus芽孢表面形成多相分布的孔隙，由短周期脉冲引起的损伤可以在短期内被封存，在此期间芽孢可以保持抗性并使PEF的灭活效率低下[75];但是，如果脉冲持续时间较长，则其造成的损害是不可逆转的[76]。此外，PEF处理效果受芽孢种类等因素的影响[77]，当PEF处理B. atrophaeus时，芽孢具有明显的孔隙，然而当PEF处理芽孢杆菌属其他芽孢时，芽孢数量并未显著降低，这表明芽孢的萌发状态及其种类会影响PEF的杀菌效果[78]。
7 其他非热杀菌技术
电离辐射、超声、臭氧处理等方法也是常用的非热杀菌技术。朱军等[79]研究发现利用60Co γ射线可以杀灭核桃粉中的微生物，当控制适宜的辐射杀菌剂量(8～9 kGy)时，辐射在不影响核桃粉品质的同时对核桃粉中的菌落总数、耐热芽孢和耐热杆菌芽孢等都具有很好的杀灭效果;超声处理常常作为其他杀菌技术的辅助处理方法，例如超声辅助加热[80]、超高压协同声热[81]、超声协同表面活性剂[82]等，这些协同杀菌技术可提高独立超声处理的杀菌效果;臭氧溶液可以对B. subtilis芽孢产生一定损伤，其机理可能是臭氧可破坏芽孢的内膜[83]。此外，使用化学试剂(环氧乙烷、二氧化氯等)也是具有良好灭活芽孢效果的方法之一，但在使用时应考虑其在具体加工环境的使用剂量及其对食品的影响[84]。
8 结 语
细菌芽孢的灭活是当前食品工业面临的重大挑战，近年来出现了大量灭活芽孢的非热杀菌技术，这些技术在相对温和的条件下进行，避免了高温对食品品质的不良影响，其中研究相对成熟的主要有HHP技术、HPCD技术、NTP技术、UV技术以及PEF技术。
HHP不仅可以导致芽孢内部结构及其理化性质的改变，还可以诱导芽孢萌芽降低其抗性以获得更好的灭活效果，但HHP对设备的要求较高，在实际生产应用中具有一定局限性。HPCD灭活芽孢的机制尚有争议，目前认为HPCD主要破坏芽孢结构进而导致灭活，单独处理对芽孢的灭活效果不佳时可与其他杀菌方式相结合以优化HPCD灭活效果。NTP技术具有温度低、速度快、能耗低、无残留等优点，自由基、离子以及UV光子等各种活性成分的积累和渗透可对芽孢外部结构和DNA、蛋白质等内部成分产生破坏，然而目前NTP技术主要作用于物料表面，处理不规则食品时需要提高其杀菌均匀性。UV 技术在食品的杀菌和货架期延长等具有重要应用，但应用UV技术需考虑其对食品品质的不良影响。
此外，由于部分非热杀菌技术灭活芽孢的程度有限，灭活机理尚未得到完全阐明，且获得的结果变化很大，严重阻碍其在食品工业中的应用;因此非热杀菌技术对芽孢灭活的影响因素及其机理是未来研究的重要内容。此外，从现有杀菌技术的协同灭活芽孢的效果来看，诱导萌发和灭活技术相结合是保持食品新鲜品质和保护食品免受芽孢杆菌侵染的有效途径，栅栏技术是具有前景的芽孢灭活方法。——论文作者：白 妍1 ，葛雨珺1 ，向迎春2 ，李 苑1 ，丁 甜1 ，胡亚芹1,*
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