本篇文章是由《广西植物》省级农业期刊论文发表，创刊于1981年，是由广西科学院主管、广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所和广西植物学会联合主办的植物学专业性学术期刊(学报级)。广西植物编辑部审稿周期为3个月，若3个月内未收到用稿通知，作者可自行处理。复合影响因子：0.936，综合影响因子：0.611。
β-胡萝卜素是联合国粮农组织和世界卫生组织一致认定的A类营养色素，是人体内维生素A的重要来源，且具有良好的抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、增强免疫等功能，在医药、食品着色及营养强化、日用化妆品及饲料添加剂等领域具有广阔的应用前景[1]。目前，市场上的β-胡萝卜素产品主要有化学合成品和天然产品两种类型。天然β-胡萝卜素因其功能性强、安全性好及生物利用度高等优点而日益受到人们的青睐。发酵法是目前生产天然β-胡萝卜素的主要途径。在可合成β-胡萝卜素的微生物中，菌种三孢布拉氏霉无论是生物量(50 g干菌体/L)，还是菌体细胞中β-胡萝卜素的含量(可达菌体干重的1%～5%)都是较理想的，已成为目前国内外研究和生产天然β-胡萝卜素的主要菌种[2]。在前期发酵条件优化的基础上[3]，本研究通过各种理化因子对生产菌株三孢布拉氏霉的负菌进行诱变选育，以期进一步提高β-胡萝卜素的发酵产量。
1 材料与方法
1.1 菌种
三孢布拉氏霉正菌(Blakeslea trispora +)、三孢布拉氏霉负菌从中国典型培养物保藏中心购买。
1.2 培养基
PDA培养基：新鲜马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、自来水1 000 mL。平板初筛培养基：含有0.3%脱氧胆酸钠(SDC)的PDA。
三角瓶复筛培养基：4%玉米粉、2%大豆粉、1%麸皮浸出液、0.1% KH2PO4、0.05%MgSO4、0.01% 维生素B1、1%植物油，pH 7.0。
1.3 孢子悬浮液制备
将活化的三孢布拉氏霉负菌接种至PDA平板培养基上，26 ℃培养5 d，每个平板加入20 mL无菌水，用接种环轻轻刮洗下表面的孢子，将孢子悬浮液合并转入装有玻璃珠的无菌三角瓶中，振荡将孢子打散形成单孢子悬浮液。
1.4 孢子诱变处理
将制备的单孢子悬浮液分别用不同剂量的紫外线(UV)或硫酸二乙酯(DES)进行处理，之后将孢子悬液涂布于平板上进行培养。
1.5 突变菌株平板初筛
将经过诱变处理后的孢子悬浮液涂布在含有0.3%SDC的PDA平板培养基上，26 ℃培养3～5 d，经过多次诱变处理，根据三孢布拉氏霉负菌菌落颜色深浅及孢子生长数量从平板上挑选了5株比较理想的突变菌株，以供复筛。
1.6 突变菌株三角瓶摇瓶复筛
将从初筛平板上挑选的菌株接种至三角瓶复筛培养基中，同时接入三孢布拉氏霉正菌，26 ℃、180 r/min培养5 d，测定其β-胡萝卜素的产量。
1.7 β-胡萝卜素产量的测定
将每瓶培养好的菌丝分别用双层纱布过滤，自来水冲洗菌丝至滤过液无色，挤干菌丝水分后置于真空干燥箱中50 ℃干燥20 h，称取干菌丝体的重量，计算生物量。将干菌丝体碾碎，称取适量干菌体粉末，加入60～90 ℃沸程的石油醚浸泡至菌粉呈白色，测定浸出液在波长450 nm下的吸光度，根据标准曲线计算出干菌体中β-胡萝卜素的含量，再算出β-胡萝卜素的产量。
2 结果与分析
2.1 β-胡萝卜素标准曲线
精确称取β-胡萝卜素标准品，用60～90 ℃沸程的石油醚溶解并稀释成不同浓度，分别测定其在波长450 nm下的吸光度。以β-胡萝卜素浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，结果见图1。
2.2 紫外线诱变致死曲线
保持紫外灯功率和照射距离不变，控制不同的时间照射三孢布拉氏霉负菌单孢子悬浮液，以照射时间为横坐标，孢子致死率为纵坐标绘制致死曲线，结果见图2。随着照射时间的延长，三孢布拉氏霉负菌单孢子致死率逐渐升高。一般认为致死率在75%左右时诱变效果较好，但三孢布拉氏霉在任何生长阶段都是多核体，且β-胡萝卜素高产突变属于隐形突变，因此必须采用高剂量诱变处理，使孢子形成生理上的单核体，才有可能得到稳定的高产突变菌株[4]，故后面的诱变处理采用10 min照射。
2.3 紫外线诱变平板初筛
经过多次诱变处理，根据三孢布拉氏霉负菌菌落颜色深浅及孢子生长数量从平板上挑选出了5株比较理想的突变菌株(表1)，以供复筛。
2.4 紫外线诱变三角瓶复筛
从表2可以看出，初筛得到的突变菌株U-4的β-胡萝卜素产量最高，为894 mg/L，比原始菌株的产量提高了39.3%，同时在平板上生长的孢子也比较丰富，所以选择突变菌株U-4作为进一步诱变的菌株。突变菌株U-5在平板上颜色很深，基本上呈红色，其β-胡萝卜素产量与原始菌株相当，说明其菌落颜色可能是一些其他的色素类物质。
2.5 硫酸二乙酯诱变致死曲线
在10 mL 菌株U-4的孢子悬浮液中加入不同量的DES，以配成不同浓度的DES，充分振荡使DES分散均匀，30 ℃振荡处理2 h后，加入5 mL 25%Na2S2O3溶液终止反应。以DES的浓度为横坐标，孢子致死率为纵坐标绘制致死曲线，结果见图3。从图3可以看出，随着DES浓度的增加，三孢布拉氏霉负菌孢子致死率逐渐升高。同样，考虑到三孢布拉氏霉是多核体，后面的诱变选育采用高致死剂量1.6% DES进行孢子诱变处理。
2.6 硫酸二乙酯诱变初筛
利用DES对突变菌株U-4的孢子进行多次诱变处理，根据菌落颜色深浅及孢子生长数量从平板上挑选出了4株比较理想的突变菌株(表3)，以供三角瓶复筛。
2.7 硫酸二乙酯诱变复筛
从表4可以看出，初筛得到的突变菌株U-D-2的β-胡萝卜素产量最高，达到1 236 mg/L，比菌株U-4提高了37.0%，比原始菌株提高了94.6%，且该菌株孢子生长情况比较理想。因此，选择突变菌株U-D-2为进一步的选育菌株。
2.8 遗传稳定性
对突变菌株U-D-2进行7次传代培养，并用三角摇瓶分别测定了每代的β-胡萝卜素产量，结果见表5。从表5可以看出，经过7次传代培养，突变菌株U-D-2的β-胡萝卜素产量变化不大，说明其具有较好的遗传稳定性。
3 小结与讨论
本试验以三孢布拉氏霉负菌作为原始菌株，采用了紫外线和硫酸二乙酯两种诱变因子，经过2次诱变处理，得到的突变菌株U-D-2较原始菌株的β-胡萝卜素产量提高了94.6%，但较其他报道的产量[5]或工业化生产还有一定的差距，这也与原始菌株产量偏低有关。因此，后面将进一步采用更高效的诱变因子，如亚硝基胍、钴辐射、等离子等进行诱变选育，以进一步提高其β-胡萝卜素的产量。
三孢布拉氏霉属于一种异宗结合菌，其β-胡萝卜素的大量合成依赖于正、负菌的结合培养。因此，三孢布拉氏霉正菌在β-胡萝卜素的大量合成中也具有重要的作用，所以今后将进行三孢布拉氏霉正菌的选育，以提高正、负菌株的结合能力及β-胡萝卜素的产量。
此外，实践表明，三孢布拉氏霉菌种保藏方法对于菌种活性及β-胡萝卜素的产量具有显著影响。斜面低温(4 ℃)保藏，平均1～1.5个月就会死亡，多次传代培养会引起明显的退化。笔者改用孢子进行沙土管保藏，可以保藏2～3年，无明显退化现象。因此，采用有效菌种保藏方式对于菌种选育也是非常重要的。
参考文献：
[1] 王 雪.β-胡萝卜素的研究进展[J].中国化工贸易，2013(5)：193.
[2] 张婷婷，葛 佳，牛天贵，等.三孢布拉氏霉菌发酵产β-胡萝卜素发酵条件的研究[J].食品科技，2009，11(34)：2-7.
[3] 颜作文，王常高，蔡 俊.三孢布拉氏霉菌产β-胡萝卜素发酵条件的优化[J].食品与发酵科技，2013，49(2)：25-29.
[4] 陆茂林，单志萍，孟 妤.多核丝状真菌的选育及遗传稳定性[J].生物技术，2002，12(2)：16-19.
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