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摘 要：运用SRAP分子标记研究了山东省3个钩齿溲疏居群的遗传多样性，结果显示，用15对引物共检测到244个位点，其中多态位点167个，物种水平多态位点百分率(PPL) 68.44%，Nei’s基因多样性指数(H) 0.2158，Shannon’s信息指数(I)0.3282，数据表明钩齿溲疏有较高的遗传多样性水平;居群间遗传分化系数(Gst)为0.3685，表明居群间遗传变异只占36.85%，远低于居群内遗传分化;在居群水平上，以崂山钩齿溲疏居群的遗传多样性最高，徂徕山最低;居群间遗传一致度(GI)和遗传距离(GD)变化范围分别为0.8350～0.8884和0.1184～0.1803，居群间的遗传距离与地理位置间没有直接相关性。
关键词：钩齿溲疏;SRAP;遗传多样性
钩齿溲疏(Deutzia baroniana)属于虎耳草科(Saxifragaceae)溲疏属(Deutzia)，落叶灌木，分布于辽宁、河北、山西、陕西、山东、江苏和河南[1]。钩齿溲疏花朵洁白，繁密而素净，花期长，且盛开于初夏，正值少花时节，宜丛植于山坡、草坪、路旁或林缘，也是岩石园、花篱的常用材料，花枝可作插花观赏。钩齿溲疏适应性非常强，常生于沟谷、林缘或岩石缝中，耐旱、耐瘠薄、抗寒，对于干旱、少雨的北方城市绿化极为适宜，是北方十分难得的园林绿化、美化材料。此外，钩齿溲疏根、叶、果还可药用。因此，钩齿溲疏具有很高的观赏和经济价值，是一种值得开发的野生植物资源，值得大力引种并繁育推广。
一个物种之所以能繁殖存活，并且适应环境改变，根本原因在于其遗传多样性[2]。北大核心期刊居群对环境的适应能力在一定程度上由居群的遗传多样性水平制约着，因此通过研究其遗传多样性水平可预测这个居群未来的发展趋势[3]。而目前尚未见从DNA水平上对钩齿溲疏的遗传多样性进行分析的研究和报道。
相关序列扩增多态性(Sequence-related amplified polymorphism，SRAP)是通过设计独特的引物对基因ORFs(Open reading frames)的特定区域进行扩增并分析的标记手段[4]。目前已成功应用于作物遗传多样性评价、指纹图谱构建、重要性状的标记以及相关基因的克隆等方面[5～8]。本研究对山东省内21份钩齿溲疏进行SRAP遗传多样性分析，旨在研究其遗传多样性水平，为开发利用钩齿溲疏野生资源、在景观应用中选育优良品种提供分子水平的依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验样品于2012～2013年采自山东崂山、泰山和徂徕山，共21份样品(表1)。同一居群相邻植株采样间距30 m以上，采取新鲜幼嫩叶片放入密封袋中，用变色硅胶干燥。记录所采样品的小地名、海拔、经纬度并编号。
1.2 DNA提取
选用改良的CTAB法[9]提取样品总DNA，用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，用紫外分光光度计检测DNA浓度后用ddH2O稀释至50 ng/μL，-20℃保存备用。
1.3 SRAP-PCR反应体系和程序
SRAP引物设计参照Li等[4]，13个正向引物和19个反向引物共组成247对引物组合，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。从中筛选出15对扩增条带数量多、清晰、稳定的引物组合(表2)用于正式扩增。
反应体系为25 μL：10×PCR Buffer 2.5 μL，模板DNA 75 ng，Mg2+ 3 mmol/L，dNTP 0.4 mmol/L，上下游引物各0.22 μmol，Taq DNA聚合酶1.5 U，用ddH2O调整使终体积为25 μL。
PCR扩增程序为：94℃预变性5 min;94℃变性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸1 min，5个循环;94℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环;72℃延伸7 min。
PCR扩增产物采用2%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭(EB)染色后在北京六一WD-9403CS型紫外仪上采集图像。
1.4 数据分析
根据扩增条带结果，选取易于识别的条带，在相同迁移率位置上，有记为1，反之为0，得到原始数据矩阵。用POPGENE 1.32统计各项遗传参数：多态性位点数NPL、多态位点百分率PPL、等位基因数Na、有效等位基因数Ne;Nei’s基因多样性指数H、Shannon’s信息指数I;居群间Nei’s遗传一致度GI和遗传距离GD;总遗传多样性Ht、群体内的遗传多样性Hs、群体间遗传分化系数Gst=Dst/Ht， Dst为群体间遗传多样性;体现基因流强度的群体每代迁移数(Nm)。应用NTSYS pc version 2.10e 软件根据Nei’s遗传相似系数利用UPGMA方法进行聚类，绘出聚类分析树状图[10]。
2 结果与分析
2.1 SRAP引物扩增多态性分析
钩齿溲疏21份样品用筛选出的15对引物扩增(表3)，共扩增出244个位点，多态性位点167个，多态性位点百分率为68.44%，说明山东省钩齿溲疏遗传多样性较高。每对引物产生的位点数为12～24个，多态性位点数为7～17个，平均每对引物产生16.27个位点和11.13个多态性位点。以ME7-EM15的多态性位点比率最高，为100%，H值和I值也均最高;ME10-EM15产生的多态位点比率最低，为38.89%，H值和I值也最低。
2.2 居群遗传多样性分析
在物种水平上，多态位点百分率(PPL)为68.44%。在居群水平上，多态位点百分率(PPL)介于32.79%～45.08%，平均为37.57%(表4);以崂山遗传多样性最高，泰山次之，徂徕山最低。由Shannon’s信息指数计算的钩齿溲疏物种水平的遗传多样性为0.3282，各居群的遗传多样性变化范围为0.1776～0.2525，平均为0.2046。由Nei’s指数计算的物种水平的遗传多样性为0.2158，各居群基因多样性介于0.1200～0.1719，平均为0.1383。该指数计算的值较Shannon’s信息指数低，但两种方法计算的三个居群的遗传多样性大小同多态位点百分率大小顺序是一致的，均是崂山最高，徂徕山最低。数据表明山东省钩齿溲疏物种水平的遗传多样性较高，居群水平的遗传多样性较低。
2.3 居群遗传结构与遗传一致度分析
对钩齿溲疏3个自然居群的遗传结构分析表明，总遗传多样性(Ht)为0.2190，其中居群内(Hs)为0.1383，居群间(Dst)为0.0807，居群内遗传多样度明显高于居群间。居群间遗传分化系数(Gst)为0.3685，即居群间遗传变异仅占36.85%，因此居群内遗传分化远高于居群间。在居群遗传学研究中，基因流被划分为高、中、低三水平[11]，而钩齿溲疏各居群间基因流(Nm)大小为0.8566，介于0.25～0.99，属于中等水平，表明居群间基因流相对有限。
统计钩齿溲疏各居群间的Nei’s遗传距离GD和遗传一致度GI以进一步分析钩齿溲疏居群的遗传结构。3个居群间遗传距离GD变动在0.1184～0.1803，平均为0.1514(表5)，以崂山与泰山的遗传距离最近，崂山与徂徕山的最远。3个居群间遗传一致度GI变化范围为0.8350～0.8884，平均为0.8598。泰山与崂山居群的遗传距离是3个居群间的最小值，遗传一致度最高，但在地理位置上距离较远;同样，泰山与徂徕山地理距离最近，但遗传一致度反比泰山与崂山的低。这表明，钩齿溲疏居群间的遗传距离和地理位置并非直接相关。
2.4 聚类分析
UPGMA聚类结果(图1)显示，泰山居群14号和15号样品遗传相似度最高，为0.91。在相似系数为0.74时所有样品可以分为3大类：第Ⅰ大类包含7个样品，全部来自徂徕山;第Ⅱ大类包括来自崂山的4个样品和来自泰山的8个样品;第Ⅲ大类只有2个样品，均来自崂山。第Ⅱ大类在相似系数为0.81处又可分为3个亚类，第1亚类含1个样品，第2亚类含3个样品，均来自崂山;第3亚类含8个样品，全部来自泰山。
由聚类图可看出，徂徕山的样品单独聚为一个大类，泰山的样品聚在一个亚类里，只有崂山的样品分布在2个大类中，这反映出崂山居群丰富的遗传多样性。同时，徂徕山样品单独聚为第Ⅰ大类，泰山和崂山的部分样品聚为第Ⅱ大类，表明了崂山与泰山的遗传相似度较高。
聚类结果显示，多数情况下样品来源决定样品间的亲缘关系，地理来源相同的样品倾向于聚在一起，但供试样品的聚类结果又并非严格按照地理来源来划分。说明山东钩齿溲疏的遗传分化并非受地理来源单一因素的影响，是多个因素综合作用的结果。
3 讨论
在体现居群内变异水平方面，多态位点百分率是重要指标之一。在物种水平上钩齿溲疏的多态位点百分率为68.44%，表明山东省内钩齿溲疏有较丰富的遗传多样性。
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