【摘要】目的：检测草苔虫内酯的遗传毒性。方法：采用Ames试验、体外培养中国仓鼠卵巢(chinesehamsterovary，CHO)细胞染色体畸变试验和小鼠骨髓微核试验检测草苔虫内酯的遗传毒性。结果：Ames试验显示在每mlA00、10、1、0.1g受试剂量下，在加或不加s9代谢活化系统时对组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100、TA102及TA1535所诱发的回复突变菌落数均与溶剂对照的突变菌落数相近。体外培养CHO细胞染色体畸变试验结果显示，在3.75、1.88和0.94g/ml3个剂量组，在加S9条件下培养24h和不加s9培养24、48h的CHO细胞染色体畸变率与溶剂对照组相比差异有统计学意义<0.05)。小鼠骨髓微核试验，在12.5、25、50g，kg3个剂量下对ICR/Jx鼠的微核诱发率呈剂量反应关系，与溶剂对照组相比差异有统计学意义(p<0.01)结论：在本实验条件下，草苔虫内酯对鼠伤寒沙门氏菌无致突变性，对哺乳动物培养细胞染色体的致畸变作用为可疑阳性，对ICR/b鼠有诱发骨髓嗜多染红细胞微核的效应，提示草苔虫内酯对人体具有潜在的遗传毒性。
【关键词】草苔虫内酯;致突变试验;Ames试验;染色体畸变试验;微核试验
草苔虫又称苔藓虫，是一种海洋苔藓类的真体腔动物，最常见的种类是总合草苔虫BugulaneritinaLinnaeus，1758)，在我国的东南沿海分布广泛。草苔虫内酯是一类来源于总合草苔虫中的大环内酯类化合物，对HL一60人早幼粒细胞白血病和K562人红细胞白血病等细胞株均有显著的抑制生长作用，能激活蛋白激酶c，具有抗肿瘤和免疫调节作用，草苔虫内酯是一类极具开发前景的抗肿瘤药物。但迄今为止，国内外未见有关草苔虫内酯安全性评价方面的公开研究报道。为提高临床用药的安全性，为了验证其是否具有遗传毒性，本实验采用微生物回复突变试验(Ames试验)、体外培养中国仓鼠卵巢(chinesehamsterovary，CHO)细胞染色体畸变试验和小鼠骨髓微核试验方法进行了检测，系统研究草苔虫内酯的遗传毒性，为草苔虫内酯的临床合理使用提供科学依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1受试物草苔虫内酯(含量>95%，批号040116)，由第二军医大学药学院提供，无色透明液体。对湿度、光照敏感，故密封、避光保存于4cc冰箱中，I临用前配制。
1.1.2菌株组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100、TA102和TA15355个菌株，由复旦大学公共卫生学院环境卫生教研室赠予，贮存于液氮中。实验前进行菌株鉴定(R因子鉴定、自发回变数鉴定)，均符合标准。
1.1.3细胞CHO细胞由中国科学院上海细胞研究所提供。
1.1.4动物选用性成熟ICR,'b鼠共50只，每组10只，雌雄各半，由上海市西普尔一必凯动物有限公司所提供，合格证号SCXK沪2003—0002。
1.2试验方法
按《新药(西药)临床前研究指导原则汇编》的设计要求，分别采用Ames试验嘲、体外培养CHO细胞染色体畸变试验方法和小鼠骨髓微核试验检测草苔虫内酯的遗传毒性。分别从基因突变、染色体畸变和DNA损伤3个方面进行了遗传毒性评价。
1.3剂量设计
Ames试验，以其最大溶解度10mg/ml为最高剂量，但经预实验结果显示该剂量有明显的抑菌作用，故剂量设计改为每皿100、10、1、0.1IXg4爪剂量组，每皿均加人相应浓度的受试物0.1ml，此外设空白对照、溶剂对照和阳性对照。每个剂量组及对照组均设3个平行皿。+S9阳性对照：TA97、TA98及TA100为2一氨基芴(每皿1Og)，TA102为1，8一二羟基蒽醌(每/11150，TA1535为环磷酰胺(每11150g)。一s9阳性对照：TA97和TA98为对二甲基氨基苯重氮磺酸钠{;{ll{{F~tRC1NOGENESIS."r~xTOGENF,SIS&MmC,ENESIS0V01.24N0.4(每JlE50，TA100和TA102为甲基磺酸甲酯f每皿1，TA1535为4一硝基喹啉一N一氧化物(每/I]10.5。溶剂对照为0.9%生理盐水。体外培养CHO细胞染色体畸变试验，根据预实验测定IC。为3.75mg/ml，故实验设高、中、低3个剂量组，剂量依次为3.75、1.88和0.94mg/ml，另设阳性对照组和溶剂对照。阳性对照组：+s9用环磷酰胺(40mg/m1);一S9用丝裂霉素c(o.5mg/m])。溶剂对照用0.9%生理盐水。CHO细胞在加代谢活化系统(+s9)的条件下，与受试物接触24h后;在不加代谢活化系统(一s9)的条件下，与受试物分别接触24和48h后，用秋水仙碱处理，使细胞的有丝分裂停止在中期相，然后收集细胞，经低渗、固定、涂片和染色后，在显微镜下观察染色体数量和结构的改变。小鼠骨髓微核试验采用小鼠经尾静脉注射给药，剂量分别为12.5、25、50g/kg(分别约相当于小鼠经静脉LD。剂量的1/8、1/4、1/2)，同时设阳性对照组和溶剂对照组。阳性对照组以40mg/kg的剂量腹腔注射一次给予环磷酰胺，给药体积按10ml/kg;溶剂对照组给药方式与受试物组相同，以10ml/kg~尾静脉注射给予溶剂0.9%生理盐水。
1.4统计学方法
Ames试验结果的评价是以比较受试物各剂量组与溶剂对照组的回复突变菌落数为基础，若某剂量组回复突变菌落数为溶剂对照组突变菌落数的2倍以上，呈现可重复性，并在一定的剂量范围内存在着剂量一反应关系，则判断为阳性;染色体畸变试验和小鼠骨髓微核试验均采用x检验与溶剂对照组进行比较，以0【=O.05为检验水准。
2结果
2.1Ames试验
受试物各剂量组和对照组的平皿均未见污染，并且可见背景菌苔生长。5个菌株的自发回复突变菌落数以及阳性对照品诱发的回复突变菌落数均在本实验室Ames试验对照范围内，并且各菌株阳性对照组的回复突变菌落数与空白对照组相比显著增加，提示本试验系统符合实验要求。在降低剂量后，未观察到受试物的抑菌现象。每ILK100、10、l、0.1g4个剂量组受试物在加或不加代谢活化系统(s9)时对TA97、TA98、TA100、TA102及TA1535所诱发的回复突变菌落数均与自发的突变菌落数相近，并且未观察到明显的剂量一反应关系。结果见表1。
2.2体外培养CHO细胞染色体畸变试验
染色体分析结果显示阳性对照组能够诱发受试细胞染色体的畸变率明显增高，加和不加代谢活化系统(S9)的条件下培养24h时染色体畸变率与溶剂对照组相比差异均有统计学(P<0.05);3.75、1.88和0.94mg/ml受试物在加与不加代谢活化系统(+S9)的条件下培养24h时染色体畸变率分别为5%、6%和7%，不加代谢活化系统的条件下诱发的细胞染色体畸变率为5%-6%，呈可疑阳性结果。结果见表2和表3。
2.3小鼠骨髓微核试验
试验结果经统计学分析，可见阳性对照组与溶剂对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。草苔虫内酯在50和25mg/kg对ICR小鼠骨髓嗜多染红细胞微核诱发率，与溶剂性对照组相比差异均有统计学意义(P<0.01)，结果见表4。
3讨论
本研究采用Ames试验、CHO细胞染色体畸变试验、小鼠微核试验测试组合，分别从体外到体内，从微生物、离体细胞和整体动物水平上系统评价该药物的遗传毒性，是《新药(西药)临床前研究指导原则汇编》推荐的标准试验组合。
本研究结果显示，本试验条件下，采用标准平板掺入法，草苔虫内酯在其最大溶解度(10mg/m1)剂量下经预实验结果显示有明显的抑菌作用，这可能与草苔虫内酯属大环内酯类药物，具有诸多抗菌活性，作用于细菌核糖体的50S亚单位，阻断mRNA移位，从而抑制菌体蛋白质合成叫有关，但在每皿100、10、1、0.1g的受试剂量下，未观察到明显的抑菌现象，在加和不加代谢活化系统(s9)时对组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌均无致突变性。对CHO细胞在3.75、1.88和0.94g/ml3个剂量组，在加s9条件下培养24h和不加s9条件下培养24、48h的CHO细胞染色体畸变率为5%～6%，呈可疑阳性结果。在12.5、25和50g/kg3个剂量下对ICR/b鼠的微核诱发率与溶剂对照组比较，50和25g，kg组微核率与溶剂对照组相比差异有统计学意义<0.01)，提示草苔虫内酯在25g/kg以上剂量对ICRd~鼠有诱发骨髓嗜多染红细胞微核的效应。对于草苔虫内酯，在本实验剂量范围内，得到体外试验可疑阳性而体内试验阳性的结果，表明在体外和体内两个系统中其均可诱发细胞的染色体损伤，提示草苔虫内酯对人体具有潜在的遗传毒性。
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