摘要：以天麻多糖为实验对象，采用响应面法优化制备天麻多糖铁的最优实验条件。以pH值、柠檬酸三钠与天麻多糖的质量比和水浴加热的温度三个单因素，建立了天麻多糖铁的响应面法合成模型。筛选出最佳的合成条件为：pH=8，温度为68.05℃，柠檬酸三钠与天麻多糖比值为3∶4。在此条件下，Design-Expert响应面软件预测的吸光度值为0.897，五组验证实验的平均吸光度为0.9299，相对误差仅为3.67%。R2=0.9990显示该回归模型可准确地预测天麻多糖铁的合成中铁含量。在最佳条件下，天麻多糖铁中铁含量为33.48%。
关键词：天麻;多糖铁;响应面法
1引言
缺铁性贫血是中国人较为常见的一种疾病，因人体对于日常所需的铁吸收不足，而铁和血红蛋白之间又有着紧密的关系，血红蛋白不足导致红细胞数目减少，从而引起体内多个组织或细胞缺氧，形成缺铁性贫血。过去一段时间，人们常用硫酸亚铁去治疗缺铁性贫血，但多数人都会因胃肠道受到刺激而应激性呕吐，铁离子被呕吐而出，铁的吸收无法达到治疗目的[1]。而临床治疗重症缺铁性贫血，人们试着从制剂方面改变药物的效果，将原有药物改进为缓释胶囊或缓释片剂，它与上代药物相比效果更好，对人体也无强烈毒副作用[2]。陈作伟等发现Fe2+易在体内产生自由基，造成细胞损伤或者凋亡[3]。上世纪九十年代，美国开始逐渐使用右旋糖酐铁和葡萄糖酸铁，它可以治疗肾衰竭患者的缺铁性贫血，并且减少生理上的不良反应，但是存在过敏反应。后来随着多糖类化合物的兴起以及它们的免疫调节作用为人们所熟悉，以Fe3+为核心，以多糖为配合物，发展成为新的补铁药物。多糖铁制剂对人体副作用小，形成的配合物稳定，有着不错的溶解度，最大优点是含铁量高。孙兰萍等研究发现，多糖铁就是多糖与铁离子的复合物，成分中不含有二价铁与三价铁，复合物以分子形式向人体提供铁元素，机体很容易将其吸收，它的还原性更优秀，体内的还原性物质能把它转化为Fe2+被吸收[4]。多糖铁可以改善人体造红细胞的功能，较好地用于治疗缺铁性贫血。
天麻，属于兰科天麻属，是多年生草本植物。天麻中含有大量的有效活性成分，主要包括天麻提取素、苷类相关物和多糖[5]。近年来的研究表明，天麻可以强健人体、开发智力、减少人体衰老细胞、消除体内自由基和抗氧化的作用，并对老年人常见病如老年痴呆有着部分疗效[6]。天麻多糖具有清除自由基、降血压和抑菌作用。
2材料和方法
2.1材料和设备
本实验天麻来自湖北神农架;乙醇、抗坏血酸、邻菲啰啉、三氯化铁等试剂均为分析纯，购自国药集团。紫外分光光度计，LAMBDA25，购自美国PerkenElmer公司;旋转蒸发器，RE-3000A，购自上海亚荣生化仪器厂;电子天平，STARTED2100型pH计购自美国A-HAUS公司;TDL-5型离心机购自上海安亭科学仪器厂;快速水分测定仪，HB43-S型梅特勒-托利多国际贸易有限公司。
2.2实验方法
2.2.1天麻多糖的制备
天麻多糖的制备参考任守利、兰金荣等[7-8]文献方法。将天麻干燥、粉碎、过筛待用。将天麻粉末按照料液比为1∶20的比例与蒸馏水混合在一起，振荡均匀，放入圆底烧瓶中。65℃恒温水浴提取3h，将提取液离心、过滤弃去滤渣。将提取液过大孔树脂除色素，待浓缩后用sevage法[9]除蛋白质并加入三倍体积95%乙醇醇沉过夜。离心后弃去上层酒精，沉淀即为天麻多糖，真空干燥得天麻多糖粉末。参照文献[7]―[8]中多糖含量检测方法，本实验室所制天麻多糖含糖量在80%以上，可以作为后续制备多糖铁的原料。
2.2.2天麻多糖铁的合成
天麻多糖铁的合成参考张新国、王峰等[10-12]文献方法。称取天麻多糖粉末0.5g和柠檬酸三钠固体粉末0.5g于圆底烧瓶中，加入50mL蒸馏水磁力搅拌溶解。在搅拌中，缓慢滴入2mol/L的三氯化铁溶液和氢氧化钠溶液。待反应液体中出现少量红棕色沉淀，而且沉淀不再溶解，停止加入以上两种试剂，继续水浴加热反应1.5h。反应结束后，离心除去沉淀，取剩余的红褐色液体。在液体中加入3倍体积的乙醇溶液，析出的即为天麻多糖铁，沉淀分别用95%乙醇、乙醚、丙酮洗涤，然后真空干燥得天麻多糖铁粉末。
2.2.3天麻多糖铁含铁量的测定
采用邻菲啰啉显色法[13]对多糖铁中铁含量进行测定，多糖铁的吸光度与实际的铁浓度呈一定关系，在波长为510nm处检测吸光度，通过标准曲线，最终得到多糖铁的含铁量。此显色反应必须采用二价铁，在显色以前，需加入少量抗坏血酸溶液避免Fe2+离子氧化。
取若干50mL容量瓶，铁(Ⅱ)标准溶液取八个点，起始点为0mL，终止点为14mL，中间点彼此间隔2mL它们分别放入准备的容量瓶内，加入10%的抗坏血酸溶液，体积为2.5mL，再加入0.1%的邻菲啰啉溶液，体积为5mL，并且定容，用力振荡，在37℃的水浴锅下反应3h，510nm测吸光度，绘制标准曲线，并得出线性关系公式，结果如图1所示，代入铁标准曲线中即可算出天麻多糖铁中铁含量。由于后期干燥的天麻多糖铁不溶于水，而不干燥的多糖铁溶于水，为了节约干燥时间，故采用直接将湿多糖铁溶于水中进行测量，通过仪器测定湿多糖铁的含水量即可算出天麻多糖铁中的含铁量。
2.2.4单因素实验
选取温度、pH和柠檬酸三钠与天麻多糖的质量比进行三个单因素实验，条件分别为：温度50℃，60℃，70℃，80℃，90℃;pH6，7，8，9，10;柠檬酸三钠∶天麻多糖为1∶4，2∶4，3∶4，4∶4，5∶4。
2.2.5响应面优化试验设计
在单因素的基础上，进一步多糖铁的合成工艺，根据Box-Behnken测试设计原理[14]，选取pH(X1)、温度(X2)、柠檬酸三钠与天麻多糖的质量比(X3)三个要素进行响应面考察，采用3因素3水平的响应面分析方法进行实验设计，并通过Design-Expert8.0.6软件进行数据处理。
3结果
3.1天麻多糖铁的响应面实验结果与分析
3.1.1天麻多糖铁合成的单因素结果
通过2.2.4单因素实验得出，最佳温度60℃，最佳pH7，最佳柠檬酸三钠与天麻多糖质量比2∶4。以pH、温度、柠檬酸三钠与天麻多糖的质量比为主要因素，设计3因素3水平实验设计，结果如表1所示。
3.1.2天麻多糖铁的响应面实验及其结果
在3.1.1单因素实验结果的基础上，根据Box-Behnken试验设计进行试验，以多糖铁的铁吸光度为响应值，结果如表2所示。
利用Design-Expert8.0.6.1软件，对表2所得的结果进行统计分析，得出天麻多糖铁合成的二次回归拟合方程：Y=-0.48649+0.04501X1+0.016478X2+0.85884X3+0.00580755X1X2+0.11290X1X3-0.00149X2X3-0.030378X1-0.000454275X2-0.73644X3，对上述回归方程进行方差分析，结果如表3所示。
由表3显示，回归模型P<0.0001，此模型极度显著。同时X1，X2和X3都是显著因素;在交互作用方面，X1X2和X1X3的交互极其显著，X21，X22和X23项都是极显著的项。失拟项的F值=5.35，P值=0.0695(>0.05)，差异性不显著;在方差分析中R2=0.9990，R2adj=0.9976，可以得出回归方程与响应面实验的拟合成果较好，所以这个模型可以用来拟合天麻多糖铁含铁量与pH、温度、柠檬酸三钠和天麻多糖的比值的变化关系。
3.1.3天麻多糖铁的响应面分析
对模型进行两因素效应分析，对影响因素的响应面图和等高线图进行分析，可以直观的表现两个因素同时对吸光度值的影响，结果如图2、图3所示。
各因素以及相互作用对响应值的影响可以通过图2、图3中响应面的陡峭程度以及等高线图的密集程度直观的反映出来。由图2(A)、图3(A1)可知，温度效应面更加陡峭，等高线相对更密集，所以温度的影响更为显著，pH次之;由图2(B)、图3(B1)可知，柠檬酸三钠：天麻多糖的效应面更加陡峭，等高线相对更密集，所以柠檬酸三钠：天麻多糖的影响更为显著，pH次之;由图2(C)、图3(C1)可知，柠檬酸三钠：天麻多糖的效应面更加陡峭，等高线相对更密集，所以柠檬酸三钠：天麻多糖的影响更为显著，温度次之。
3.2验证实验
通过响应面优化设计，得到了合成天麻多糖铁的最优条件为：pH=8，温度68.05℃，柠檬酸三钠与天麻多糖的比值为3∶4，此实验条件下的天麻多糖铁的吸光度为0.897。对此结果进行验证性实验，实验条件与上述最优条件保持一致(温度粗调为68℃)，做六组平行实验，六组的吸光度数值分别为1.0331，0.8842，0.9452，0.9129，0.9520和0.9250，平均吸光度为0.9299，与预测值的误差为3.67%，在可接受的误差范围内，说明此响应面优化设计模型的拟合结果良好。
4结论
本实验以天麻多糖为研究对象，采用Box-Be-hnken的中心组合试验并通过响应面分析pH、温度、柠檬酸三钠与天麻多糖比值三个因素的交互关系对天麻多糖铁合成的影响。结果响应面优化合理，通过回归和检验分析模拟的二次项方程都具有很好的拟合性和有效性。优化得到天麻多糖铁的最佳合成工艺为pH=8、温度为68℃、柠檬酸三钠与天麻多糖比值为3∶4，此时天麻多糖铁的吸光度为0.9299。经称量一组湿天麻多糖铁总重为5.5253g，含水量为84.12%，代入铁标准曲线中计算得出含铁量为33.48%。验证试验表明此方程具有可预测性，为天麻多糖铁的合成提供了一定的方法依据。
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