摘要：目的探讨SOX10过表达对胶质瘤细胞增殖和去分化的影响。方法胶质瘤细胞株U87转染SOX10腺病毒48h后收集细胞进行MTY、流式细胞术、Westernblot和Q.RT.PCR。结果U87细胞感染SOX10过表达腺病毒后细胞的增殖受抑制，DNA合成减少，s期细胞数减少，干细胞标志CD上调。结论SOX10可能在胶质瘤细胞的去分化中起重要作用。
关键词：SOX10;胶质瘤细胞;增殖;去分化
近年研究表明，细胞的去分化与肿瘤的发生及其恶性程度有关，肿瘤细胞去分化可以向高度恶性去分化，也可以向低度恶性去分化，2J，肿瘤细胞去分化与胚胎发育和干细胞相关基因的激活密切相关。SOX10作为胚胎期神经干细胞的重要转录因子，参与神经干细胞的迁移和分化J。2010年1月一2011年12月我们进行本研究，在功能成熟的髓鞘细胞SOX10过表达可导致神经胶质细胞瘤的发生_4j，在人类胶质瘤中SOX10在幼儿胶质瘤中高表达J，在成人低度恶性胶质瘤中表达也较高6]，提示SOX10可能与胶质瘤细胞的去分化有关。本研究探讨SOX10过表达是否对神经胶质瘤U87细胞去分化有影响。
1材料与方法
1.1主要仪器及试剂细胞购自协和细胞库，DMEM培养基(HyClone公司)，胎牛血清(FBS，HyClone公司)，相差显微镜及荧光倒置显微镜(Olym.pus)，细胞培养箱(HealForce)，全自动酶标仪，流式细胞仪，MTI"试剂盒(AmericanTypeCultureCollection)、碘化丙啶(PI，Sigma)。
1.2病毒构建提取人脑组织mRNA，逆转录制备cDNA。PCR扩增SOX10目的序列，上游引物5一GTCAGAATI'CATGGCGGAGGAGCAGGACCTAT一3、下游引物5-GTCAAAGC唧AGGGCCGGGACAGTGTCGTA.3。产物用EcoRI和HindII1核酸内切酶双酶切后纯化处理，连接入PDC316.eGFP载体中，构建过表达穿梭质粒，将此质粒与pBHGlox(delta)E1.3Cre质粒用脂质体lipofectamine2000共转染293A细胞，24h后在荧光显微镜下观察转染情况，可见有eGFP绿色荧光蛋白表达，每天换液，7～10d即可见重组腺病毒噬斑，即表明SOX10过表达腺病毒包装成功。此时收集上清液并大量感染新的293A细胞，以扩增足够量的腺病毒，纯化后备用。用同样的方法制备空载腺病毒。
1.3U87胶质瘤细胞培养及病毒转染U87细胞用DMEM培养基+10%FBS+1%青霉素/链霉素于37℃、5%CO，、饱和湿度培养箱中常规培养，每3d消化传代换液。3～7代细胞状态良好可用于实验。细胞加入0.25%的胰酶消化成单细胞悬液，10%的血清终止消化后再次离心去上清，用培养液重悬细胞后种在35cm的培养皿中，分成正常对照组、空载体病毒转染对照组、重组SOX10腺病毒转染组(感染剂量预实验获得)后继续培养，分别在24、48h时在荧光显微镜下观察转染情况。
1.4Q.RT.PCR检测干细胞相关基因表达收取转染48h后的细胞用TRIzol法提取RNA，用第1链合成试剂盒反转录成cDNA，进行Real—timePCR测定。在PCR反应体系中分别加入相同浓度的cD.NA、特异引物、DNA聚合酶、dNTP、反应bufer、去离子水和SYBRGreen荧光染料，每个样本反应平行重复3管，同时做GAPDH平行管对照，进行荧光定量PCR反应。引物序列分别为：GAPDH(human)：上游5.GAAGGTGAAGGTCGGAGTC.3、下游5一GAAGATGGTGATGGGArnTI1C一3;CD(human)：上游5.CTCTYGAATGAAACTCCAGAGCAA-3、下游5一ATTCCGCCTCCTAGCACTGA-3;S100b(human)：上游5-AGGGAGGGAGACAAGCACAA一3、下游5一CGCCGTCTCCATCATrGTC.3;GFAP(human)：上游5.TTGAGAGGGACAATCTGGCAC.3、下游5.GTG.GCTICATCTGCTYCCTGT一3;Nestin(human)：上游5.TGGCGCACCTcAAGATGTc一3、下游5-AGGGAArITI’GCAGCTCCAGCT-3;p75NT(human)：上游5.TCCTGGCTGCTGTGGTI'GT-3、下游5一CCACT.GTCGCTGTGGAGrITI耵一3;Olig2(human)：上游5.ACAGAGCCGGAGCTGCAGCA-3、下游5-ATCTI'G.GAAAGCTYGCGCACCG.3。
1.5MTI'法检测细胞增殖U87细胞按2x10/孔接种于96孔板培养48h，设置调零组、对照组、空载体病毒转染对照组、重组SOX10腺病毒转染组，每组8个孔，4个剂量。弃掉旧培养液加入含20LMTr溶液(5mg/mL)的新鲜培养液200L继续培养4h，终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150IxL二甲基亚砜置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪波长490nm处测量各孔的吸光度值(OD)。
1.6Westernblot检测SOX10蛋白表达收取转染48h的细胞，用常规蛋白裂解液裂解细胞提取总蛋白，10%SDS—PAGE胶电泳，PVDF膜湿转300mA60min，用5%脱脂牛奶液室温封闭1h，加入一抗4cI=冰箱孵育过夜，洗膜，加二抗室温孵育1h，洗膜，滴加HRP发光液，暗室曝光，显影。所用抗体为羊抗人SOX10(1：500，SantaCruz)。
1.7流式细胞术测细胞周期细胞用胰酶消化成单细胞悬液3mL，冰上迅速加入无水乙醇到10mL(终浓度70%)，迅速摇匀不使细胞结块，冰上放置30min，离心去掉酒精，PBS洗2遍，用1mLPBS重悬细胞，加人10IxLRNA酶，37℃孵育30min，用前加入10LPI，流式细胞仪测细胞周期。
1.8统计学方法采用SPSS17.0软件进行统计处理，组问比较用完全随机设计单因素方差分析，若有统计学意义，采用SNK—q法或LSD.t法进行两两比较，所有分析均采用双侧检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1SOX10对细胞形态的影响及转染SOX10蛋白的表达验证转染后在倒置荧光显微镜下观察细胞的绿色荧光表达情况，发现转染后48h绿色的细胞比例最高可达80%一90%，细胞状态良好(插页I图1)，细胞突起变少，SOX10定位在细胞核。因此选择了48h收集细胞进行实验。Westernblot结果显示病毒转染后SOX10过表达(图1)，转染后的U87细胞中SOX10.GFP的融合蛋白及SOX10本身的表达量均高于空载对照组，说明SOX10转染成功。
2.2MTI法检测重组SOX10腺病毒对U87细胞增殖的影响转染不同剂量的SOX10腺病毒48h后对U87细胞增殖均有抑制作用，其中1.5L/mLSOX10处理的U87细胞组细胞增值率为(0.45±0.05)%与对照组的(1.03±0.08)%相比差异有统计学意义(P<0.01)。
2.3Q—RT—PCR检测干细胞相关基因表达水平胶质瘤U87细胞系转染SOX10腺病毒48h后，干细胞标志CDmRNA转录水平比对照组(Contro1)明显增加(P<0.05)，Nestin、p75NTR也有增加趋势，说明U87细胞在转染SOXIO腺病毒后可能发生了向干细胞逆转的去分化。见表1。
2.4流式细胞术检测SOX10腺病毒对U87细胞周期的影响见表2。SOX10腺病毒转染组病毒剂量采用1.5L/mL。结果说明SOX10可以影响细胞周期，抑制DNA合成，这与抑制增殖的结果相符。
3讨论
在成人脑肿瘤中，最为常见和恶性程度最高的是胶质瘤，诊断后平均生存期为1a。现目前对胶质瘤的发展过程仍然不十分清楚。在原发胶质瘤中通常有遗传突变J。转录因子SOXIO首先出现在发育中的神经嵴，并在周围神经系统的形成过程中表达，在中枢神经系统SOX10先出现在神经胶质前体细胞，以后在成人脑的少突胶质细胞也被检测到。
去分化指在某些特殊条件下，已经分化的细胞改变了原来的分化程序，失去已有的结构和功能，逆转成为原始幼稚的干细胞状态。肿瘤细胞具有去分化的能力，能复活胚胎发育基因和干细胞J。去分化肿瘤是指低度恶性的肿瘤向原始状态逆转或再分化成为另一类高度恶性的肿瘤_1。肿瘤的去分化与肿瘤的发生、发展及浸润和转移密切相关。我们的研究探讨了SOX10对胶质瘤细胞去分化有何影响。结果发现转染不同剂量的SOX10腺病毒对U87细胞的增殖有抑制作用，而且引起突起减少形态的改变，并表达神经嵴干细胞的标志分子，因此SOX10可能对胶质瘤有去分化的作用。同时实验表明转染重组SOX10腺病毒后U87细胞周期S期减少，G/M期增多，说明SOX10可以将细胞阻止于s期，抑制DNA合成，也提示SOXIO抑制U87细胞的分化，并向去分化逆转。这一发现对深入理解胶质瘤恶性变与去分化的关系提供了很好的启示，为胶质瘤诱导分化疗法提出新的思路
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