摘要目的:建立凌霄花薄层色谱鉴别方法。方法:以毛蕊花糖苷为对照品，考察不同展开剂、显色剂、温度、湿度对薄层色谱的影响，确定供试品溶液配制方法和最佳的薄层色谱条件。结果:采用薄层色谱高效硅胶G板，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(1∶7∶1)为展开剂室温下展开，先置于365nm紫外灯下检视，再喷以10%磷钼酸乙醇溶液加热显色，日光下检视，所得凌霄花薄层色谱分离效果和显色效果较佳，斑点清晰且特征性好。结论:该鉴别方法操作简便易行，定性特征明显、结果易于判定、专属性较好，能够准确鉴别凌霄花药材，值得推广应用。
关键词凌霄花;薄层色谱鉴别;毛蕊花糖苷
凌霄花FlosCampsis，又名芰花、紫葳华、陵霄花、堕胎花，为紫葳科Bignoniaceae凌霄属Campsis植物凌霄Campsisgrandiflora(Thunb.)K.Schum.或美洲凌霄C.radicans(L.)Seem.的干燥花，为我国传统中药[1，2]，始载于《神农本草经》，列为中品;性味甘、酸、寒，归肝、心包经，具有活血通经、凉血祛风的功效;主治月经不调、经闭癥瘕、产后乳肿、风疹发红、皮肤瘙痒，痤疮等[2～4]。文献报道，凌霄花化学成分主要为脂肪醇、脂肪酮、脂肪酸、甾醇、cyclohexylethanoid、五环三萜、酚酸、黄酮及花色素、环烯醚萜及苷、苯丙素苷、以及挥发油等[5，6]。
药材市场上凌霄花的销售价格一直较高，其伪品较为多见。凌霄花与其伪品的药理活性差别较大，如使用不当，可发生严重的不良反应[7，8]。因此，凌霄花的鉴别具有重要意义。已有研究采用HPLC-ELSD法建立凌霄花药材的指纹图谱，用于凌霄花药材的质量控制[9]，但该方法的仪器配置要求高、药材前处理步骤繁琐、分析时间长、检测费用昂贵，因此并不适用于凌霄花鉴别的实际工作需求。本课题组一直关注于凌霄花药材的真伪鉴别与品质评价，对凌霄花，及其常见的伪品或混淆品泡桐花、曼陀罗花、闹羊花、木槿花等花类药材进行了较为深入的研究，建立了一种简便易行、专属性好的TLC色谱鉴别方法，现报道如下。
1仪器与试药
1.1仪器与试剂
电子分析天平，Quintix224-1CN型(最大载荷220g，分度值0.1mg)，德国Sartorius公司产品;中药粉碎机，Q-500B3型，上海冰都电器有限公司产品;数控超声清洗器，KQ-500DE型，昆山市超声仪器有限公司产品;数显式电热恒温水浴锅，XMTD-204型，上海博讯实业有限公司医疗设备厂产品;暗箱四用紫外分析仪，ZF-8型，上海骥辉科学分析仪器有限公司产品。
玻璃点样毛细管，加强型(0.3mm×100mm)，华西医科大学仪器厂生产;薄层色谱展开缸，P型(200mm×200mm)，上海信谊仪器厂生产;薄层色谱高效硅胶G板，批号:20160902(10mm×20mm)、批号:20160108(50mm×100mm)，薄层色谱硅胶GF254板，批号:20160912(50mm×100mm)，青岛海洋化工有限公司生产;薄层色谱聚酰胺薄膜板(批号:20161027，200mm×200mm，浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂生产)。试验用水为重蒸水。其他试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。
1.2药材
毛蕊花糖苷对照品(批号:111530-201208，供含量测定用，纯度92.5%);熊果酸对照品(批号:110742-201622，供含量测定用，纯度94.7%);凌霄花对照药材(批号:121122-201203，供薄层色谱鉴别用)，以上对照品及对照药材均购于中国食品药品检定研究院。
凌霄花、美洲凌霄花药材，以及泡桐花、曼陀罗花、木槿花、闹羊花药材均于2016年9～10月采集或购自河北安国中药材批发市场，经上海长征医院药学部吴志军主任药师鉴定，结果见表1，以上药材标本均存放于解放军第97医院药剂科标本室。
2方法与结果
2.1中国药典凌霄花TLC鉴别方法
按中国药典2015年版一部方法[2]，称取毛蕊花糖苷对照品、熊果酸对照品适量，加入甲醇，分别配制成0.5mg·ml-1的毛蕊花糖苷对照品溶液、熊果酸对照品溶液(实验编号分别为V、U);称取凌霄花对照药材以及上述凌霄花、泡桐花、曼陀罗花、木槿花、闹羊花药材样品粉末各0.5g，分别加入石油醚(60～90℃)15ml，超声处理(240W，45kHz)15min，滤过，弃去石油醚滤液，药渣加入甲醇15ml，超声处理(240W，45kHz)15min，滤过，滤液蒸干，残渣加入甲醇1ml使溶解，分别制成药材样品溶液(实验编号分别为Cc、C1～C8、P、D、H、R)。使用玻璃点样毛细管吸取上述对照品溶液、药材样品溶液各2μl，分别点于同一薄层色谱高效硅胶G板上，以三氯甲烷-甲醇(9∶1)为展开剂，室温下展开，取出，晾干，首先置于紫外灯(365nm)下检视，然后置于碘蒸气中熏至斑点显色清晰，置于日光下检视，结果见图1-1a、图1-1b。
改进中国药典方法，将展开剂更换成甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)，同法展开，取出，晾干，首先置于紫外灯(365nm)下检视，然后喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃下加热至斑点显色清晰，置于日光下检视，结果见图1-2a、图1-2b。
对中国药典方法进行分析:由于展开剂为三氯甲烷-甲醇(9∶1)，极性较小，以致薄层板中Cc、C1～C8点样点上方部分空间无明显显色斑点，即大多数特征极性化合物未展开。针对药典方法的不足，本课题组经多次试验尝试后，将展开剂改进为甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)，增大其极性，并改进显色剂，先置于365nm紫外灯下检视，再喷以硫酸乙醇溶液加热显色。从鉴别结果上看，提高了展开程度与分离效果。但如图1-2a所示，于紫外灯下检视，凌霄花与泡桐花区分不明显。如图1-2b所示，喷以硫酸乙醇溶液加热显色，凌霄花与曼陀罗花、木槿花区分不明显;在与熊果酸对照品Rf值相同的位置上，凌霄花与闹羊花均显示相同的红色斑点。可见药典方法用于凌霄花药材的TLC色谱鉴别效果不佳。
2.2凌霄花TLC鉴别方法的改进
2.2.1对照品溶液的制备称取毛蕊花糖苷对照品适量，置于10ml量瓶中，加入甲醇溶解定容，配制成0.8mg·ml-1的溶液，作为对照品溶液(编号为V)。
2.2.2供试品溶液的制备称取凌霄花对照药材以及上述凌霄花药材粉末各0.5g，加入乙酸乙酯10ml，超声处理(240W，45kHz)15min，滤过，弃去乙酸乙酯滤液，药渣加入甲醇10ml，超声处理(240W，45kHz)15min，滤过，滤液蒸干，残渣加入甲醇1ml使溶解，作为凌霄花供试品溶液(编号分别为Cc、C1～C8)。同法配制泡桐花、曼陀罗花、木槿花、闹羊花样品溶液(编号分别为P、D、H、R)。
2.2.3TLC色谱条件的考察按照中国药典2015年版四部通则0502中薄层色谱法[10]进行薄层色谱条件的考察。
2.2.3.1不同展开剂的考察使用玻璃点样毛细管吸取上述制备的对照品溶液V、供试品溶液C1各2μl，分别点于同一薄层色谱高效硅胶G板上，C1平行试验3次，分别以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(1∶7∶1)、乙酸乙酯-甲醇-甲酸(16∶0.5∶2)、三氯甲烷-甲醇(9∶2)为展开剂，室温下展开，取出晾干后置于紫外灯(365nm)下检视;再喷以10%磷钼酸乙醇溶液，在105℃下加热至斑点显色清晰，置于日光下检视。结果见图2。结果表明，采用甲苯-乙酸乙酯-甲酸(1∶7∶1)展开后，斑点丰富且清晰，分离度高，因此确定展开剂为甲苯-乙酸乙酯-甲酸(1∶7∶1)。
2.2.3.2不同显色剂的考察使用玻璃点样毛细管吸取上述制备的对照品溶液V、供试品溶液C1各2μl，分别点于同一薄层色谱高效硅胶G板上，C1平行试验3次，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(1∶7∶1)为展开剂，室温下展开，取出晾干后置于紫外灯(365nm)下检视;再分别喷以10%磷钼酸乙醇溶液、5%香草醛硫酸溶液、10%硫酸乙醇溶液，在105℃下加热至斑点显色清晰，置于日光下检视。结果见图3。结果表明，喷以10%磷钼酸乙醇溶液加热显色后，斑点显色明显且清晰，因此确定显色剂为10%磷钼酸乙醇溶液，且显色前，先置于365nm紫外灯下检视。
2.2.3.3不同温度的考察使用玻璃点样毛细管吸取上述制备的对照品溶液V、供试品溶液C1各2μl，分别点于同一薄层色谱高效硅胶G板上，C1平行试验3次，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(1∶7∶1)为展开剂，分别于室温和4℃(薄层色谱展开缸和展开剂提前放到该温度下饱和3h)下展开，取出晾干后置于紫外灯(365nm)下检视;再喷以10%磷钼酸乙醇溶液，在105℃下加热至斑点显色清晰，置于日光下检视。结果见图4。结果表明，温度对展开效果影响不大，因此确定色谱温度为室温。
2.2.3.4不同湿度的考察使用玻璃点样毛细管吸取上述制备的对照品溶液V、供试品溶液C1各2μl，分别点于同一薄层色谱高效硅胶G板上，C1平行试验3次，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(1∶7∶1)为展开剂，室温下分别于相对湿度为18%、42%、65%、88%(将装有硫酸-水混合溶液的烧杯提前放置薄层色谱展开缸内饱和2h)下展开，取出晾干后置于紫外灯(365nm)下检视;再喷以10%磷钼酸乙醇溶液，在105℃下加热至斑点显色清晰，置于日光下检视。结果见图5。结果表明，毛蕊花糖苷对照品Rf值没有明显改变，湿度对展开效果影响不大，在相对湿度18%～88%下，色谱行为稳定。
2.2.4凌霄花TLC色谱鉴别方法使用玻璃点样毛细管吸取上述制备的对照品溶液V、对照药材溶液Cc、供试品溶液C1～C8、P、D、H、R各2μl，分别点于同一薄层色谱高效。
图4不同温度下凌霄花药材展开显色的TLC鉴别图硅胶G板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(1∶7∶1)为展开剂，室温下展开，取出晾干后先置于紫外灯(365nm)下检视，再喷以10%磷钼酸乙醇溶液，在105℃下加热至斑点显色清晰，置于日光下检视，结果见图6。结果表明，凌霄花供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点或斑点，伪品和混淆品能被显著区分。
3讨论
3.1伪品或混淆品药材的选择
文献报道，凌霄花常见的伪品或混淆品有泡桐花FlosPaulowniae[11，12]、木槿花FlosHibisci[13]、闹羊花FlosRhododendriMollis[13，14]、洋金花FlosDaturae[14]等。依据文献及药材性状区分的难易，本课题组选用白花泡桐Paulowniafortunei、曼陀罗D.stramonium、木槿Hibiscussyriacus[3]、羊踯躅Rhododendronmolle[2]的干燥花作为鉴别的伪品或混淆品对照。
3.2对照品的选择
凌霄花的化学成分中，脂肪醇、脂肪酮、脂肪酸、甾醇、五环三萜、黄酮类化合物为脂溶性化合物，极性较小，而苯丙素苷、环烯醚萜及苷、酚酸类化合物为水溶性化合物，极性较大。其中，苯丙素苷(phenylpropanoidglycosides)为一类含取代苯乙基和肉桂酰基的天然糖苷，结构较为复杂，存在于双子叶植物中，含量低微，一般仅为0.02%～0.4%[15，16]。毛蕊花糖苷(verbascoside)，又名麦角甾苷(acteoside)、阿克替苷、是凌霄花中主要的苯丙素苷类化合物，含量可达0.1%左右[17]。考虑到苯丙素苷类化合物非广泛存在于植物体内，故本课题组选择毛蕊花糖苷作为凌霄花鉴别对照品，具有一定的生化系统学和天然药物化学根据，可体现出鉴别的特征性，有效克服药典方法仅使用凌霄花对照药材作为鉴别对照的不足。从试验结果上看，在与毛蕊花糖苷对照品Rf值相同的位置上，凌霄花对照药材Cc、凌霄花药材C1～C8斑点明显，特征性良好，与伪品或混淆品药材显著区分;且伪品或混淆品药材明显无毛蕊花糖苷斑点，特别是喷以磷钼酸乙醇溶液加热显色后，凌霄花药材鉴别斑点清晰，分离度良好，结果容易判断，也适用于与其他药材进行TLC色谱鉴别。
3.3供试品溶液的制备
采用乙酸乙酯提取后弃去提取液的前处理方法进行供试品溶液制备，相对于石油醚，乙酸乙酯极性较大，能够提取除去挥发油、脂肪醇、脂肪酸及谷甾醇等非极性或弱极性化合物，还能提取除去熊果酸、齐墩果酸、黄酮苷元及苷等中等极性化合物，避免了下一步甲醇提取液中以上化合物对色谱鉴别的干扰，并有利于其后大极性展开剂展开，可有效提高分离效果和显色效果。
3.4展开剂、显色剂的确定
本课题组通过系列试验，选择并确定展开剂为极性相对较大的甲苯-乙酸乙酯-甲酸(1∶7∶1)，在高效硅胶G板上进行薄层色谱，该方法能够较好地展开并分离毛蕊花糖苷等大极性化合物。毛蕊花糖苷对照品于365nm紫外灯下显较强蓝色荧光，与其结构中含有长共轭π键相一致;凌霄花、美洲凌霄花药材在与毛蕊花糖苷对照品Rf值相同的位置上，均显较强蓝色荧光斑点，提示凌霄花、美洲凌霄花中均含有毛蕊花糖苷，与文献[18]报道结果一致，故而确定显色剂为先置于365nm紫外灯下检视，再喷以10%磷钼酸乙醇溶液加热显色日光下检视。经上述方法显色后，色谱斑点丰富、明显、清晰，分离度好，且温度、湿度对展开效果影响不大，其色谱行为稳定。
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