摘要：以威廉环毛蚓(Pheretimaguillemi)为试验生物，研究贵州万山矿区水稻土中汞[w(总汞)为0.14—76mg。kg～，w(甲基汞)为0.65—3.8g·]的生物有效性。暴露试验结果表明，矿区土壤中甲基汞的生物富集因子(BAF)为5.37l7.55，高于无机汞的生物富集因子(0.14—1.14)，说明甲基汞生物有效性比无机汞更高，具有潜在的生物放大效应。对蚯蚓体内汞形态的分析表明，蚯蚓体内甲基汞占总汞比例为0.26%～4.23%，高于土壤中甲基汞占总汞比例(<0.1%)。随着土壤中汞浓度的增加，蚯蚓体内w(无机汞)(0.20—10.20mg·kg)和w(甲基汞)(7.2—47.8txg·kg)增加。土壤无机汞浓度与蚯蚓体内无机汞浓度之间呈极显著线性相关(P0.05)。综合文献调研结果，发现土壤无机汞浓度能较好地预测蚯蚓体内无机汞的富集。尽管万山矿区汞被认为是“惰性汞”，但研究表明这些汞对蚯蚓仍具有较高的有效性，并可能在陆生生态系统中对蚯蚓捕食者产生潜在的生态风险。
关键词：汞矿区;总汞;甲基汞;蚯蚓;生物有效性
汞是人体非必需的有毒重金属元素。我国汞污染问题非常严重1-4]。贵州省汞矿区土壤汞浓度可高达790mg·kg，远超GB15618-1995《土壤环境质量标准》规定的限值(1.5mg·kg)。区域性土壤汞污染对于生态环境和人体健康的威胁已引起广泛关注。
目前大多数研究集中于土壤汞对植物的有效性，对土壤动物如蚯蚓的有效性研究较少j。蚯蚓生物量占土壤无脊椎动物生物量的80%，在农业生态系统功能方面具有重要作用，常常作为土壤污染的重要指示生物【。而且蚯蚓位于陆生食物链的低端，汞富集不仅会对蚯蚓产生直接致毒作用，还会通过食物链传递到捕食者，如鸟类、小型哺乳动物等。例如，荷兰Blokland地区土壤汞污染导致蚯蚓体(以干重计)内W(汞)达到1.1mg·kg～，以蚯蚓为食的黑尾豫(Limosalimosa)蛋(以干重计)中(汞)显著增高到0.33mg·kgJ。此外，由于蚯蚓蛋白含量高达70%，微量元素含量丰富，是禽畜和水产养殖动物的优质蛋白质饲料。因此，研究蚯蚓的汞富集对土壤汞污染监测和陆生食物链汞传递的风险评估都具有重要意义。
近期野外研究已表明汞能在蚯蚓体内富集。我国葫芦岛区域蚯蚓总汞含量可高达5.5mg·kg～，具有潜在的生态与环境风险H“。由于甲基汞具有较强的生物可利用性和毒性，因此其比无机汞更能引起人们的关注。事实上，甲基汞在蚯蚓体内的生物富集因子(bioaccumulationfactor，BAF，。)可达10.2—249ll卜J，远高于无机汞的生物富集因子(通常<10【13])。因此，研究蚯蚓体内汞的化学形态对准确地进行风险评估具有重要意义。
在土壤重金属的生物有效性研究中，人工标记土壤由于具有易控性而被广泛使用。鉴于人工标记土壤和实际污染土壤重金属的生物有效性差别，实际污染土壤在重金属的生物风险评估中更具有现实意义。贵州省万山汞矿是我国最大的汞矿¨。万山地区稻米甲基汞含量严重超标”。该研究拟采用中国常见的蚯蚓种属威廉环毛蚓(Pheretimaguillemi)作为试验材料来分析比较万山矿区土壤中无机汞和甲基汞生物有效性的差异，以期为全面评估万山矿区汞污染风险提供基础数据。
1材料与方法
1.1供试材料
1.1.1供试动物
供试蚯蚓为威廉环毛蚓，购自江苏省句容市蚯蚓饲养基地。将蚯蚓置于空白对照土壤，在人工气候箱中驯养30d。箱中温度为(20±1)℃(贵阳花溪水稻土)，相对湿度为60%，t(光)：t(暗)=8h：16h，[光]照度为400lx。每周按照每g蚯蚓(湿重)配给0.75g干牛粪的比例喂食蚯蚓¨。每次喂食前移走未进食的干牛粪，并用去离子水调节土壤湿度为最大饱和含水率的60%。
1.1.2供试土壤
供试土壤取自贵州万山矿区附近水稻田(汞污染土壤)和贵阳花溪水稻田(空白对照土壤)。取样深度为0～20cm。所有土样取回后自然风干，研磨过2mm孔径筛后常温保存。
.暴露试验设置6个处理，每个处理设置3个重复。用自动搅拌机混合污染土壤和空白对照土壤形成混合均匀的试验土壤，总汞浓度梯度为0.1、l、3、27、50和76mg·kg～，分别以CK、T1、T3、T27、T50和T76表示。总汞浓度为0.1mg·kg的试验土壤采自贵阳花溪水稻土，作为空白对照土壤;总汞浓度为76mg·kg的试验土壤采自贵州万山矿区附近水稻土，作为最高浓度汞污染土壤。多次测定土壤中汞浓度以确保混合的均一性。根据《土壤农业化学分析方法》¨，测定土壤pH值[0.01tool·L～CaC1，，(水)：m(土)=10：1]、有机质含量(OM，重铬酸钾容量法)、阳离子交换量(CEC，醋酸铵法)、土壤最大饱和含水率(WHC，饱和重力排水法)、矿物组成(x射线衍射)和颗粒组成(激光粒度分析)等基本的土壤理化性质。
将含不同浓度梯度汞土壤250g分别置于PP材质烧杯中，用去离子水调节土壤湿度为最大饱和含水率的60%，放在人工气候箱中预培养平衡4d。
1.2暴露试验
暴露试验开始前，挑选体质量相近的[(1.8±0.23)g]具有环带的健康成年蚯蚓随机放在湿润的滤纸上24h，使其排除肠道内容物_20J。滤纸每12h更换1次。参照OECDNo.3172方法进行蚯蚓暴露试验。简而言之，经过清肠处理的蚯蚓随意放置于任意一个盛有试验土壤的烧杯内，每个烧杯放入5条蚯蚓，任意选择其中3条测定汞浓度，暴露条件与驯养条件(同1.1.1节所述)保持一致。每天观察并记录蚯蚓活性，同时每2d用去离子水调节土壤湿度为最大饱和含水率的60%。21d时结束试验，先后用W=0.8%的NaC1引、10mmol·L一的半胱氨酸溶液和去离子水清洗蚯蚓，以移除蚯蚓体表的微生物，去除附着的土壤颗粒及吸附的汞。蚯蚓在湿润滤纸上清肠24h后称重。暴露前后的土壤和蚯蚓样品在-70℃条件下保存备用。
1.3土壤和蚯蚓样品中总汞和甲基汞的测定
蚯蚓和土壤样品冷冻干燥(ALPHA1—2LDplus，德国)48h后磨碎过<0.15mm孔径筛备用。根据EPA7473方法用直接测汞仪(DMA一80，Milestone，意大利)测定样品总汞浓度，仪器检测限为0.01ng。根据EPA1630方法_2和阎海鱼等6_的方法采用气相色谱一冷原子荧光法(GC-CVAFS，MERX，BrooksRandLabs，美国)测定样品甲基汞浓度，检测限为0.01Pg。简而言之，0.01～0.05g样品用2mLW=25%的氢氧化钾一甲醇溶液在65℃条件下消解4h。先调节消解液pH值，再经四乙基硼化钠(NaBEt)乙基化后测定。
1.4试验数据的质量控制
分析所用试剂均为优级纯(GR)，试验用水为去离子水(Milipore，18.2MQ)。用空白试验、标准工作曲线、土壤标准物质(GBW07423，GSS一9，国家标准测量研究所)和生物标准物质(龙虾，TORT-2，加拿大国家研究委员会;海鱼，DORM一3，加拿大国家研究委员会)对试验数据进行质量控制。土壤标准物质和生物标准物质的总汞回收率分别为90%一110%和85%～96%，甲基汞回收率分别为77%一123%和85%一88%。
2结果与讨论
2.1土壤中总汞和甲基汞的浓度
所采集的贵州万山矿区土壤(处理T76)总汞浓度为76mg·kg(表1)，约为GB15618-1995三级标准限值的5l倍，此与前人报道结果'一致;土壤中W(甲基汞)为2.7Ixg·kg～，占总汞浓度比例<0.1%(表1)，此与文献报道结果'如J一致，说明在万山矿区土壤中，汞主要以无机汞形式存在。万山矿区土壤中80%的无机汞以硫化汞形态存在。贵阳花溪未污染水稻土(CK)W(总汞)为0.14mg·kg～，W(甲基汞)为0.65Ixg·kg～。
将万山土和花溪土混合均匀形成不同梯度的汞浓度[表1，W(总汞)为0.14～76mg·kg～，W(甲基汞)为0.65—3.8g·kg]，均为环境暴露浓度.2。尽管甲基汞浓度随土壤总汞浓度的增加而增加，但土壤中甲基汞的比例仍均小于0.1%(除CK以外，表1)。
2.2无机汞和甲基汞的生物富集
2.2.1蚯蚓体内汞浓度及形态
蚯蚓体内无机汞和甲基汞浓度见表2。在整个试验过程中，汞污染土壤培养的蚯蚓总汞和甲基汞浓度均高于CK，尤其是处理T76(万山矿区稻田土)蚯蚓W(无机汞)和W(甲基汞)分别达(10.20±2.20)mg·kg一和(47.8±12.5)g·kg一，其中，蚯蚓W(总汞)高于我国葫芦岛地区蚯蚓W(总汞)(5.5mg·kg)。。这说明尽管万山矿区汞主要以硫化汞等隋性汞”形式存在，但仍然对土壤无脊椎动物(蚯蚓)具有生物有效性。蚯蚓对甲基汞的F.可达5.37～17.55，略低于文献报道值，如1O.2～31.4、15.1～191.5E和175～249，进一步说明存在甲基汞在土壤一蚯蚓体系中的生物放大现象。
蚯蚓体内甲基汞占总汞比例为0.26%～4.23%(表3)，略低于一些文献报道值：瑞士森林蚯蚓体内甲基汞占总汞比例为5.7%～10%l121，我国葫芦岛地区杜拉蚓和异唇蚓体内甲基汞占总汞比例分别为3%和12%。可见，蚯蚓体内汞主要以无机汞形式存在。但考虑到土壤中甲基汞占总汞比例小于0.1%(表1)，而蚯蚓体内甲基汞占总汞比例达0.26%～4.23%(表3)，说明在土壤一蚯蚓体系中可能存在甲基汞的生物放大现象。关于甲基汞生物放大现象早有研究卜”J，说明土壤一蚯蚓体系内存在甲基汞生物放大现象不是某一地区土壤或者某一种属蚯蚓的特例，这是一种普遍现象，这也是蚯蚓可以作为土壤汞污染指示生物的最直接证据。
为进一步了解无机汞和甲基汞的生物有效性，计算其F.。蚯蚓对无机汞的，b.为0.14～1.14(表4)，此与文献[11—12]报道结果基本一致。而蚯蚓对甲基汞的F.可达5.37～17.55，略低于文献报道值，如1O.2～31.4、15.1～191.5E和175～249，进一步说明存在甲基汞在土壤一蚯蚓体系中的生物放大现象。
2.2.2土壤中汞浓度对汞富集的影响
蚯蚓体内无机汞浓度与土壤无机汞浓度呈极显著正相关(图la，P<0.O1)，且土壤无机汞浓度可解释蚯蚓无机汞浓度变化的94%。但蚯蚓体内甲基汞浓度与土壤甲基汞浓度之间却不存在显著相关关系(图lb，P>0.05)。无机汞及甲基汞的F均不受土壤总汞浓度的影响(表4，P>0.05)。然而蚯蚓体内甲基汞占总汞比例随着土壤中甲基汞浓度的增加而呈下降趋势(表1和表3，P<0.05)。美国马里兰州污染土壤中的汞在蚯蚓体内富集也存在类似现象。
为进一步研究土壤中无机汞浓度或甲基汞浓度对蚯蚓汞富集的影响，对有关蚯蚓富集总汞和甲基汞数据的文献进行分析总结(图I)。若将瑞士34个地区L1土壤中蚯蚓体内无机汞浓度和甲基汞浓度分别与土壤无机汞和甲基汞浓度作相关分析，发现蚯蚓体内无机汞浓度与土壤无机汞浓度不呈显著相关关系(图Ic，P>0.05)，同样地，蚯蚓甲基汞浓度与土壤甲基汞浓度也不呈显著相关关系(图1d)。造成上述结果的原因可能是瑞士地区所采集的蚯蚓种属是多样的，不同种属蚯蚓之间对汞的富集存在差异，且土壤甲基汞浓度都很低(绝大部分地区≤1g·kg)。如将笔者研究结果与美国马里兰州的汞污染土壤¨以及辽宁省葫芦岛地区_1研究结果进行整合分析(图1e～f)，发现蚯蚓体内无机汞浓度与土壤无机汞浓度呈现极显著线性相关(图1e，R0.47，P系(图If，P>0.05)。笔者研究结果(图1a～b)与之一致，说明土壤中无机汞浓度可以预测蚯蚓体内无2040608O机汞浓度的变化，而土壤甲基汞浓度不能很好地预测蚯蚓体内甲基汞浓度的变化。
值得注意的是，除了土壤中无机汞和甲基汞浓度存在差异以外，土壤性质和蚯蚓生理因素也可能同时影响土壤中无机汞和甲基汞的富集。例如土壤有机质能增强汞对蚯蚓的生物有效性，而HNO可提取态汞则能很好地预测蚯蚓体内汞浓度。此外，蚯蚓的不同摄食方式也会产生汞富集能力的差异，例如，摄食土壤过程中总汞的富集效率高于摄食植物叶和根的过程引。这些生物生理因素和土壤性质对蚯蚓富集汞尤其是甲基汞的影响，将是下一步工作的重点。
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3结论
(1)万山矿区汞污染土壤的无机汞和甲基汞均能被蚯蚓富集，说明“惰性汞”仍然具有生物有效性。
(2)生物富集因子计算结果表明蚯蚓对甲基汞的富集能力远高于无机汞。因此，蚯蚓体内甲基汞占总汞比例为0.26%～4.23%，高于土壤中甲基汞占总汞比例(<0.1%)。可见，土壤甲基汞可能沿着陆生食物链进行生物放大。
(3)威廉环毛蚓对土壤无机汞的富集与土壤中无机汞浓度之间呈现极显著线性相关关系(P<0.01)，但对土壤甲基汞的富集与土壤中甲基汞浓度之间却不存在显著线性关系，说明土壤甲基汞浓度不是甲基汞富集的限制性因素。
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