鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyprinidherpesvirusⅡ,CyHV-2)，又称为疱疹造血器官坏死病毒(或金鱼造血器官坏死病毒)，属疱疹病毒目、疱疹病毒科、鲤疱疹病毒属(Cyprinivirus)。由于是第二个分离自鲤科鱼类的疱疹病毒，该病毒被国际病毒系统分类委员会命名为鲤疱疹病毒Ⅱ型[1-2]。该病毒为双链DNA病毒，无囊膜包被的核衣壳呈六角形或球形，囊膜包被下的病毒粒子成椭圆形，大小为175~200nm[3]。该病毒在中国、日本、美国、澳大利亚、新西兰及欧洲一些国家均有报道，可造成养殖鲫鱼(Carassiusauratus)和金鱼大量死亡。现阶段针对鲤疱疹病毒Ⅱ型的感染尚无有效的防控措施，不能有效地控制该病的暴发，因此，早诊断、早隔离、早防控是控制该病蔓延的有效手段。笔者基于国内外的相关研究进展，就鲤疱疹病毒Ⅱ型的免疫学检测、分子生物学检测、细胞培养分离等检测技术进行了详细的分析与梳理，以期为鲤疱疹病毒Ⅱ型的及早诊断及防控提供借鉴和思路。
1研究机构分布
随着鲤疱疹病毒Ⅱ型在世界范围内传播，并对金鱼、鲫鱼养殖业造成重大经济损失，国内外研究人员对鲤疱疹病毒Ⅱ型的检测技术开展了多方面的研究，以期做到病毒的早诊断、早隔离、早防控。目前国内外关于鲤疱疹病毒Ⅱ型检测方法的相关报道共有60余篇，国内授权相关发明专利10余项。国内的研究机构主要有上海海洋大学、中国水产科学研究院、四川农业大学、苏州大学、华中农业大学、南京师范大学、西南大学、南京农业大学、甘肃农业大学等(图1、表1)。世界范围内，除我国外，日本、美国、德国、英国、捷克、法国、波兰、意大利、澳大利亚以及印度等对鲤疱疹病毒Ⅱ型的检测方法也进行了相关研究(图2)。
2免疫学检测方法
2.1酶联免疫吸附测定技术
酶联免疫吸附测定(ELISA)技术是利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法，是免疫学中的经典检测技术，具有灵敏度高、特异性强、操作简单、适用于基层等优点。目前，已建立的鲤疱疹病毒Ⅱ型的酶联免疫吸附测定检测技术主要有两种：双抗夹心酶联免疫吸附测定和间接酶联免疫吸附测定。徐晔等[4]以抗ORF90单克隆抗体作为捕获抗体，酶标抗ORF90多克隆抗体为检测抗体，建立了鲤疱疹病毒Ⅱ型双抗夹心酶联免疫吸附测定检测技术。该检测方法具有良好的特异性，与鲤春病毒血症病毒、流行性造血器官坏死病毒、传染性造血器官坏死症病毒、锦鲤疱疹病毒、传染性胰腺坏死病毒、鲑鱼传染性贫血病毒、草鱼出血病病毒等病毒无交叉反应;检测灵敏度高，对40份无临床症状的样本检测发现，夹心酶联免疫吸附测定方法的阳性检出率为45%，而PCR技术的阳性检出率仅为37.5%。此外，以抗ORF25单克隆抗体为检测抗体，以酶标羊抗鼠IgG为二抗，建立了鲤疱疹病毒Ⅱ型间接酶联免疫吸附测定检测技术。利用该技术对无感染和感染鲤疱疹病毒Ⅱ型银鲫(Carassiusauratusgibelio)的脾脏、鳃、肾脏的总蛋白进行检测，发现鲤疱疹病毒Ⅱ型感染鱼的脾脏、鳃和头肾样品中，酶联免疫吸附测定结果为阳性(P/N值>2.1)，而无感染鲤疱疹病毒Ⅱ型鱼组织检测为阴性(P/N值<2.1)[5]。
2.2免疫荧光检测技术
免疫荧光检测技术(IFA)又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的技术，它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术，具有特异性强、灵敏度高、检测速度快等优点。目前，国内外以单克隆抗体为检测工具，针对病毒的不同靶抗原建立了多种鲤疱疹病毒Ⅱ型免疫荧光检测技术。Wu等[5-6]分别利用抗鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF25单克隆抗体，借助呆鲦鱼(Pimephalespromelas)肌肉细胞系(FHM)和鲫鱼脑细胞(GiGB)进行病毒培养后，构建了鲤疱疹病毒Ⅱ型间接免疫荧光检测技术。结果显示，鲤疱疹病毒Ⅱ型感染的细胞中均出现明显的绿色荧光信号。Kong等[7-8]分别研制了抗鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF72和ORF92单克隆抗体，以病鱼脾脏、肾脏等组织为检测对象，借助冷冻切片技术构建了鲤疱疹病毒Ⅱ型间接免疫荧光技术。结果显示，病鱼脾脏、肾脏组织中均观察到明显的阳性信号，表明基于两种单抗建立的免疫荧光技术可用于鲤疱疹病毒Ⅱ型的早期检测。多克隆抗体由于具有制备简单、效价高等优点，近年来也被广泛应用于病毒的快速检测，目前已建立了基于抗鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF121、ORF92、ORF4重组蛋白多克隆抗体的间接免疫荧光检测技术，结果显示，此技术具有很好的适用性和特异性[9-11]。
相关期刊推荐：《水产科学》杂志是由辽宁省水产学会主办的水产科技期刊，辽宁省一级期刊，1982年创刊，是中文水产、渔业类核心期刊和全国农业系统优秀期刊之一。杂志主要刊载渔业资源、海淡水捕捞、水产养殖与增殖、水产生物病害及防治、水产饲料与营养、水产品保鲜与加工综合利用及水产基础科学等方面研究的新进展、新技术、新方法等。杂志主要刊载渔业资源、海淡水捕捞、水产养殖与增殖、水产生物病害及防治、水产饲料与营养、水产品保鲜与加工综合利用及水产基础科学等方面研究的新进展、新技术、新方法等。
3分子生物学检测方法
3.1普通PCR检测技术
多聚酶链式反应简称PCR技术，是一种在DNA聚合酶作用下体外扩增特异DNA片段的技术，具有操作简便、灵敏度高、特异性强等特点。目前，国内外已建立了针对鲤疱疹病毒Ⅱ型不同靶基因的PCR检测方法。Waltzek等[12]以鲤疱疹病毒Ⅱ型解旋酶基因作为靶基因，建立的PCR检测技术，可特异性扩增366bp的目的片段。该技术灵敏度高，对鲤疱疹病毒Ⅱ型的最低检测限为78拷贝/μg;并且与鲤疱疹病毒Ⅰ型、鲤疱疹病毒Ⅲ型、斑点叉尾鮰病毒3种疱疹病毒无交叉反应。Boitard等[13]利用常规PCR扩增技术，对患病鲫鱼进行鲤疱疹病毒Ⅱ型解旋酶基因的特异性检测，结果呈阳性，测序表明与日本毒株核苷酸序列100%同源。以针对鲤疱疹病毒Ⅱ型三联体蛋白基因序列的特异性引物，对鲤疱疹病毒Ⅱ型进行PCR检测，结果显示，特异性扩增片段为218bp，最低检测限为2×104拷贝/μL，与鲤疱疹病毒Ⅰ型、锦鲤疱疹病毒、传染性脾肾坏死病毒等病毒无交叉反应，采用此方法对我国9个省市采集的鲫鱼样品进行检测，阳性检出率为81%[14]。雷燕等[15]针对鲤疱疹病毒Ⅱ型建立了一种PCR快速检测技术，其特异性扩增片段为526bp，该技术特异性强，与鲤疱疹病毒Ⅰ型、鲤疱疹病毒Ⅲ型、草鱼出血病病毒、鳜鱼弹状病毒、真鲷虹彩病毒、病毒性神经坏死病毒、病毒性出血败血症病毒均无交叉反应。薛中仪等[16]建立了一种基于Chelex-100的DNA快速提取与PCR快速扩增于一体的鲤疱疹病毒Ⅱ型分子学检测方法，其对鲤疱疹病毒Ⅱ型进行检测仅需3h，极大地提高了检测效率。
3.2双重PCR检测技术
双重PCR是指在同一PCR反应体系里加上两对引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理、反应试剂和操作过程与普通PCR相同，但更为高效、简捷和准确。罗丹等[17]针对鲤疱疹病毒Ⅱ型三联体蛋白基因的两段保守序列作为扩增靶标合成引物，建立了双重PCR检测技术，可特异性扩增出218bp和369bp两条目的片段，对鲤疱疹病毒Ⅱ型最低检测限为3×102拷贝/μL，与基于相同基因而建立的普通PCR检测技术(检测限为2×104拷贝/μL)[14]相比，双重PCR检测的灵敏度更高。谢亚君等[18]针对鲤疱疹病毒Ⅱ型解旋酶基因建立的双重PCR检测技术，可特异性扩增出800bp和250bp两条目的片段，对鲤疱疹病毒Ⅱ型的检测限为1.4×104拷贝/μL。对不同地区采集的54尾异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)组织样本进行鲤疱疹病毒Ⅱ型检测，检出率为72.2%。由此可见，鲤疱疹病毒Ⅱ型三联体蛋白基因保守序列更适合作为双重PCR检测技术的扩增标靶。
3.3巢式PCR检测技术
巢式PCR扩增技术是一种建立在常规PCR技术上，设计两对引物(巢式引物)对模板进行两轮PCR扩增反应;在第一轮扩增中，以外引物对目的片段进行扩增，以此扩增产物作为模板用内引物进行第二轮扩增，巢式PCR增加了检测的敏感性和可靠性。2013年，法国首次运用巢式PCR技术对鲤疱疹病毒Ⅱ型进行了检测，显示出良好的适用性[19]。针对鲤疱疹病毒Ⅱ型解旋酶基因序列而建立的巢式PCR检测技术，对鲤疱疹病毒Ⅱ型最低检测限可达到2.4×10-2拷贝/μL;应用此方法对不同地区采集的54尾异育银鲫检测鲤疱疹病毒Ⅱ型，检出率高达90.7%[18]。潘晓艺等[20]根据鲤疱疹病毒全基因组最为保守的末端酶基因编码区设计针对鲤疱疹病毒Ⅰ型、鲤疱疹病毒Ⅱ型和鲤疱疹病毒Ⅲ型的通用引物，建立了能同时检测鲤疱疹病毒3种病毒的巢式PCR检测方法，其灵敏度比同引物的普通PCR高1000倍，大大降低了对鲤疱疹病毒Ⅱ型检测假阴性的可能。此外，徐进等[21]根据鲤疱疹病毒Ⅱ型核酸序列开发的巢式PCR检测试剂盒，其最低检测限为10个拷贝;并且与锦鲤疱疹病毒、大鲵虹彩病毒、斑点叉尾鮰病毒、鳗鲡疱疹病毒等4种DNA病毒均无交叉反应。利用该试剂盒对5个鲫鱼样本进行检测，阳性检出率为100%。
3.4实时荧光定量PCR技术
实时荧光定量PCR，是一种可以实现DNA定量分析的检测方法，相对于普通PCR、双重PCR、巢式PCR检测技术来说，具有高灵敏度和特异性且可以对病毒进行准确定量。目前，国内外已建立了多种针对鲤疱疹病毒Ⅱ型的实时荧光定量PCR检测技术，均表现出良好的特异性和灵敏度。Goodwin等[22]针对鲤疱疹病毒Ⅱ型DNA聚合酶基因，建立了实时荧光定量PCR检测技术，对范围102~107拷贝/μL之间的鲤疱疹病毒Ⅱ型均有较好检测效果，且与鲤疱疹病毒Ⅰ型、鲤疱疹病毒Ⅲ型均不反应。Minamoto等[23-24]也建立了鲤疱疹病毒Ⅱ型的实时荧光定量PCR检测技术，并表现出很好的适用性。徐晔等[25]基于鲤疱疹病毒Ⅱ型DNA聚合酶基因序列建立的Taqman实时荧光定量PCR检测技术，其灵敏度高，可达5拷贝/μL;特异性强，与锦鲤疱疹病毒、流行性造血器官坏死病毒、病毒性出血性败血症病毒、传染性胰腺坏死病毒、鲤春病毒血症病毒无交叉反应。谢亚君等[18]和周勇等[26]针对鲤疱疹病毒Ⅱ型解旋酶基因分别建立了实时荧光定量PCR检测技术，对鲤疱疹病毒Ⅱ型的最低检测限可达2.4×10-2拷贝/μL，用此方法对54尾采集自不同地方的异育银鲫进行检测，对临床样本的检出率是89%。姚卓凤等[27-28]针对胸苷激酶基因(TK基因)和CyHV-16基因，建立了鲤疱疹病毒Ⅱ型荧光定量PCR检测方法，利用该技术对患病鱼组织中病毒分布检测发现鲤疱疹病毒Ⅱ型在脾脏和肾脏中含量最高。针对病毒衣壳蛋白基因而建立的Taqman实时荧光定量PCR，对鲤疱疹病毒Ⅱ型最低可检测到10个拷贝数，该方法同样具有很好的特异性，对锦鲤疱疹病毒、中华鳖虹彩病毒、流行性造血器官坏死病毒、斑点叉尾鮰病毒、对虾白斑综合症病毒等均无交叉反应[29-30]。佘蓉等[31]根据鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF6基因序列设计并合成特异性引物及Taqman探针，建立了荧光PCR检测技术，此方法表现出了较好的特异性，能够最低检测到32个拷贝的鲤疱疹病毒Ⅱ型核酸分子。基于鲤疱疹病毒Ⅱ型三联体蛋白基因序列而建立的SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR技术，最低检测出30个病毒核酸分子拷贝数，且重复性较好，与多种病毒无交叉反应;应用该方法对我国部分省市疑似鲤疱疹病毒Ⅱ型症状的异育银鲫进行检测，结果表明鲤疱疹病毒Ⅱ型的阳性检测率为92%[14]。
3.5环介导等温扩增(LAMP)检测技术
环介导等温扩增法是一种新颖的恒温核酸扩增方法，是指针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件保温30~60min，完成核酸扩增反应。环介导等温扩增是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点，检测成本远低于荧光定量PCR。目前，已建立的鲤疱疹病毒Ⅱ型环介导等温扩增检测技术主要聚焦于病毒基因序列中较为保守的解旋酶基因[32-36]，不同学者所建立的方法、检测时间和灵敏度有所不同，其检测时间最短可在30min内完成[33-34]，检测灵敏度最高可达10-3拷贝/μL[35]。此外，还建立了针对鲤疱疹病毒Ⅱ型末端酶基因、DNA聚合酶基因和三联体蛋白基因的环介导等温扩增技术，经验证均具有良好的特异性和灵敏度[18,37-39]。Li等[40]针对鲤疱疹病毒Ⅱ型建立了一种环介导等温扩增与横向流动试纸条相结合的一种新颖的检测技术。该检测需在64℃下反应60min，最低的检测限为4.93×104拷贝/μL;特异性强，对鲤疱疹病毒Ⅰ型、锦鲤疱疹病毒、传染性脾肾坏死病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、对虾白斑综合症病毒以及青蟹呼肠孤病毒等多种病毒无交叉反应。该方法的耗时相对较长，且灵敏度相对不够高，但操作简单，可实现养殖生产中的现场操作。郝贵杰等[41]也建立了一种结合环介导等温扩增和核酸横向测流的检测方法，经验证，此方法对低拷贝病毒样本、保存条件较差的鲤疱疹病毒Ⅱ型DNA也有良好的检测效果，对冻融次数多达20次的带毒样本依然具有100%的检出率。
3.6其他分子检测技术
Ding等[42]针对鲤疱疹病毒Ⅱ型建立了基于寡核苷酸探针的鲤疱疹病毒Ⅱ型荧光原位杂交(FISH)检测技术，此技术具有良好的特异性，经验证在43℃时荧光强度最大，探针质量浓度在5ng/μL时获得足够特异的荧光，但探针质量浓度过高(50ng/μL)，会导致荧光强度增高而特异性降低。Wang等[43]通过制备鲤疱疹病毒Ⅱ型感染鱼样品的外周血细胞涂片，建立了原位杂交技术(ISH)，发现探针与感染鲤疱疹病毒Ⅱ型的鱼样品相结合呈蓝色反应，而与未感染鱼样品不结合。Yang等[44]根据GenBank中公布的鲤疱疹病毒Ⅱ型和鲤春病毒血症病毒的核苷酸序列信息设计引物，建立了可同时检测鲤疱疹病毒Ⅱ型和鲤春病毒血症病毒的实时荧光定量PCR技术，此方法对两种病毒的最低检测限约为88个拷贝，且具有良好的特异性。齐立斐等[45]以鲤疱疹病毒Ⅱ型基因保守区域片段为靶序列设计特异性引物，建立了一种集核酸快速提取和竞争性互补介导核酸恒温扩增(CAMP)微流控芯片于一体的检测方法，其对鲤疱疹病毒Ⅱ型最低检测限为10拷贝/μL，与鲤疱疹病毒Ⅲ型无特异性扩增，特异性良好，对89批次样本进行检测，检出率为100%。郝中香等[46-47]分别通过设计合成ORF6基因和DNA聚合酶基因特异性引物及TaqMan探针，建立了鲤疱疹病毒Ⅱ型微滴式数字PCR(ddPCR)检测技术，对鲤疱疹病毒Ⅱ型最低检测限为3.77拷贝/μL。徐进等[48]根据鲤疱疹病毒Ⅱ型的helicase基因编码序列设计CPA引物，建立了一种交叉引物扩增(CPA)检测技术，此技术对鲤疱疹病毒Ⅱ型具有良好的特异性;最低检测限为10拷贝/μL。Wang等[49]针对鲤疱疹病毒Ⅱ型建立了一种基于重组聚合酶扩增技术(RPA)与侧向流动免疫层析技术(LFD)相结合的检测方法。此方法在38℃水浴中反应10min，通过肉眼便可观察到检测结果，对鲤疱疹病毒Ⅱ型的检测限高达5pg，比常规PCR技术灵敏度高近百倍，且均不与传染性皮下及造血组织坏死病毒、对虾白斑综合症病毒、草鱼出血病病毒、鲤春病毒血症病毒、锦鲤疱疹病毒等水生病毒发生反应，具有良好的特异性。此外，利用终点PCR技术和重组酶介导扩增(RAA)技术对鲤疱疹病毒Ⅱ型检测，也表现出良好的特异性和灵敏度[50-53]。
4细胞培养分离技术
细胞培养分离技术是指将细胞培养成致密单层细胞后，将病毒接种于细胞上，置于适当的环境中进行培养，当感染细胞出现显著细胞病变(CPE)后获得病毒悬液。细胞培养分离技术是病毒诊断的最准确的方法，也是世界动物卫生组织推荐检测鱼类病毒的首选方法。Jung等[54]率先利用细胞培养分离技术对鲤疱疹病毒Ⅱ型进行分离鉴定，分别将患病鱼的肾脏和脾脏组织匀浆上清接种于呆鲦鱼肌肉细胞系(FHM)、鲤鱼(Cyprinuscarpio)上皮瘤细胞系(EPC)、鳗鲡(Anguillajaponica)肾脏细胞系(EK-1)、大鳞大麻哈鱼(Oncorhynchustshawytscha)胚胎细胞系(CHSE-214)、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)性腺细胞系(RTG-2)、莫桑比克罗非鱼(Oreochromismossambicus)卵巢细胞系(TO-2)6种细胞系中对鲤疱疹病毒Ⅱ型分离。结果发现呆鲦鱼肌肉细胞、鲤上皮瘤细胞系、莫桑比克罗非鱼卵巢细胞系可出现细胞病变，其余3种未发生细胞病变，但鲤疱疹病毒Ⅱ型在呆鲦鱼肌肉细胞、鲤鱼上皮瘤细胞、莫桑比克罗非鱼卵巢细胞3种细胞系中的增殖均不能超过4代。李茂等[55]将感染鲤疱疹病毒Ⅱ型病样滤液接种到呆鲦鱼肌肉细胞中，虽经培养后出现细胞病变，但不能发生良好的传代效果。Daněk等[56]研究表明，呆鲦鱼肌肉细胞系和鲤上皮瘤细胞系可对鲤疱疹病毒Ⅱ型进行分离，感染病毒的细胞可出现明显的细胞病变，但仅能传代一次。Takafumi等[57]发现鲤疱疹病毒Ⅱ型可在金鱼鳍条细胞系(GFF)和一种建立在金鱼鳍中的细胞系(SRTF)中持续增殖，且在这两种细胞系中发生的细胞病变相似，在金鱼鳍条细胞系中可持续传代超过12代。Jeffery等[58]利用锦鲤鳍条细胞系(KF-1)、蓝鳃太阳鱼(Lepomismacrochirus)细胞系(BF-2)以及鲤鱼上皮瘤细胞系3种细胞系对鲤疱疹病毒Ⅱ型进行分离，发现鲤疱疹病毒Ⅱ型在锦鲤鳍条细胞系细胞中培养10d后可出现细胞病变，但仅能传代到第2代。我国多位学者将感染鲤疱疹病毒Ⅱ型病鱼组织匀浆上清接种在锦鲤鳍条细胞系中，培养7~10d后都可发现明显的细胞病变，最多可传至第5代[59-61]。Sahoo等[62]利用从锦鲤鱼鳍中提取的细胞系(CCKF)对鲤疱疹病毒Ⅱ型进行分离，在病毒滤液感染细胞5d后，可观察到细胞病变，但病毒在锦鲤鱼鳍细胞系(CCKF)第4代后便不再发生细胞病变。李霞等[63]将金鱼疱疹病毒感染的金鱼肾脏组织制备为病毒滤液接种到金鱼鳍条细胞系(GFF-P4)中，培养到第3天出现细胞病变，病毒在金鱼鳍条细胞中可传至第5代。夏思瑶等[64]构建了银鲫背鳍组织细胞系(CCF)，鲤疱疹病毒Ⅱ型接种后3d，病毒滴度可达到106拷贝/mL，6d后出现典型的细胞病变。目前，异育银鲫脑组织细胞(GiGB)是可用于鲤疱疹病毒Ⅱ型体外培养与分离最为稳定的细胞。在病毒接种后72h后可出现明显的细胞病变，且可传代50多次，病毒滴度可高达107.5±0.37/mL[65-67]。——论文作者：
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